泰万菌素对大鼠胃菌群的影响

周应培，冯莉莉

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.长沙道勤生物科技有限公司，湖南长沙410129）

试验研究

泰万菌素对大鼠胃菌群的影响

周应培1,2，冯莉莉1,2

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.长沙道勤生物科技有限公司，湖南长沙410129）

为了解泰万菌素对大鼠胃内菌群结构的影响,试验采用PCR-DGGE技术分离方法分析大、小剂量泰万菌素作用下大鼠胃内细菌的变化情况及其停药后恢复状态。结果显示：泰万菌素作用时，大鼠胃内细菌数量减少，菌群多样性降低，且在大剂量组效果显著；停药后仅有两种细菌恢复，大、小剂量组各有2种、4种细菌消失。泰万菌素在某种程度上能抑制细菌的生长，但也可以间接促进某些细菌生长，总体而言泰万菌素对大鼠肠道菌群结构的影响不大。

泰万菌素；DGGE；胃；菌群结构

胃在动物消化、吸收营养等方面具有重要意义，同时，胃内菌群结构在维持胃正常功能方面发挥着至关重要的作用。然而，近年来，由于抗生素的滥用，造成了消化道菌群结构紊乱、细菌间的交互耐药性等方面的问题。为此，英国伊科动物保健公司开发出比同类型大环内酯类抗生素在抗菌谱、作用强度、毒副作用等方面更具优势的泰万菌素,其作用机理是阻断肽链延伸，导致细菌难以合成蛋白质，从而发挥杀灭有害菌的治疗效果。但抗生素在杀灭有害菌的同时也可能抑杀有益菌，故探究泰万菌素是否对消化道内细菌产生严重伤害有一定意义，但目前国内外对这方面的研究较少，本研究采用PCR-DGGE技术探讨泰万菌素对大鼠胃内菌群的影响及用药后细菌恢复力。

1 材料与方法

1.1 试验动物

Wester大鼠18只，体重180±8 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 主要试剂及仪器

泰万菌素，购自湖南某生物科技股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA片段快速纯化/回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；变性梯度凝胶电泳仪系统（DGGEK-2001），购自美国CBS公司。

1.3 方法

1.3.1 试验动物处理与试验方法

将大鼠连续预饲7 d后，随机分成3组（分别为对照组、小剂量组、大剂量组），每组6只。

以纯净水溶解泰万菌素，使其浓度为11.6 mg/50mL和23.2mg/50mL，分别供大、小剂量试验组自由饮用，连续3d。对照组自由饮用纯净水。第4 d后，两试验组停药，改饮纯净水。

分别于投药后的第4 d、11 d取样，取样方法是：每组随机取鼠3只，无菌条件下分别取胃内容物约2 g置入无菌离心管内，加入灭菌生理盐水（300μL），然后300 r/min离心10min，移取上清液至另一干净离心管，12 000 r/min，10min，弃上清，沉淀备用。

1.3.2 样品细菌总DNA提取

取沉淀，加入缓冲液，蛋白酶k消化，按细菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取细菌基因组DNA，操作见说明书。

1.3.3 细菌16S rDNA V3区扩增

以 细 菌 总 DNA 为 模 板 ，341F（5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 907R（5’-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’）为引物，进行第一轮扩增。以上述PCR产物为模板，以341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC CGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)为引物，进行第二轮扩增，产物即为细菌16S rDNA V3区。上述扩增体系为：细菌DNA模板2.0μL，上、游引物各1μL，TransTaqHiFiSuperMix 25 μL，补加 ddH2O 至50μL。扩增条件为：95℃ 5min；95℃ 30 s、66℃30 s、72.0 ℃ 12 s，32 个循环；72.0 ℃ 7min。

取第二轮PCR产物5μL，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳30min，观察结果。

1.3.4DGGE电泳及产物处理

取第二轮PCR产物10μL，点样于预先制备好的变性凝胶点样孔，在60℃、300 V电压下预电泳10min，再电泳7.0 h。取出凝胶，EB染色20min，观察，拍照，分析。

紫外光下切取DGGE胶中明亮、清晰的条带，冲洗3次至灭菌EP管中，以DNA片段快速纯化回收试剂盒纯化回收DNA片段。产物与pMETeasy载体连接，转化DH5α感受态细胞，阳性克隆，送至深圳华大基因科技服务有限公司测序。

1.3.5 数据处理

将测序序列与GenBank上已登录序列进行Blast比对，寻找相似度最高的同源性序列。用Quantity One v4.6.2构建DGGE电泳谱图进行分析。

2 结果与分析

2.1 细菌16S rDNA V3区扩增结果

上述样品经二轮扩增，产物大小约为200bp，与预计大小一致，见图1。

图1 大鼠胃内细菌16S rDNA V3区扩增片段

2.2 细菌16S rRNA V3区DGGE电泳结果分析

用上述扩增的细菌16S rRNA V3区产物进行DGGE电泳，结果见图2。

图2 大鼠胃细菌菌群DGGE电泳图

从图2可见：大鼠饮用泰万菌素后，细菌种类有所减少，如小剂量组A2、A6、A8等条带消失，大剂量组A2、A3、A4等条带消失；细菌数目下降，如小剂量组A5、A7条带亮度降低，大剂量组A10条带亮度减弱；有新的细菌出现，如小剂量组A9、A13条带出现，大剂量组A9条带出现。停药后，相对于用药期：细菌数目下降，如小剂量时的A1、A12、A13等条带消失，大剂量时的A9、A12消失；而用药时消失的细菌部分恢复，如停药后A2、A10条带重新出现。停药后细菌种类没有恢复到原来状态，但有恢复趋势。

2.3 优势条带测序结果与分析

本实验切取13条DGGE优势条带，纯化、回收，经测序、比对后，选择与之最相近菌种，结果见表1。

表1 DGGE回收条带序列比对结果

从表1中可见：胃内存在细菌有乳酸菌、粪芽孢杆菌、志贺氏杆菌、产气荚膜梭菌和巴氏梭菌等杆菌属和梭菌属，其相似度大97%以上。

结合图2和表1，用药后条带发生了明显的变化，一些细菌丰度降低，另一些细菌丰度升高，胃内细菌多样性降低,这一现象在高浓度作用时更显著。停药后细菌短时间内未恢复到原来状态，但有恢复倾向。这与陈凤[1]（2015）研究：口服抗生素后肠道菌群发生改变，停药3周后肠道菌群恢复到原来状态结果相近。

3 讨论

泰万菌素导致胃内菌群结构不同程度的改变，其潜在影响因素可能有如下几种：

（1）泰万菌素的抗菌作用，大环内酯类抗生素对需氧革兰阳性菌、部分革兰阴性菌有很好的抑杀作用[2]。同时，一些抗生素可抑制消化道内有害菌的生长，如诺氟沙星可干扰致病菌DNA复制来抑制致病菌生长。

（2）胃内细菌形成相互竞争，相互制约的关系，当一种细菌减少或消失时，另外一种细菌可能因为获得其生态位或失去制约而疯长。如：朱小翠认为，芽孢杆菌（Bacillus）能参与生物夺氧，降低肠道内局部的氧分压，维持肠道环境的稳定，抑制某些细菌的生长[3]。

（3）胃内微生态改变，在泰万菌素的作用下胃内菌群结构改变，引起其微生态发生变化。新的条件更适于一些细菌的生长，而不利于另外一些菌的生长。

（4）泰万菌素在胃内的吸收效果，胃由于胃酸的作用，同时大环内酯类抗生素为弱碱性[4]，泰万菌素在胃内可能由于被中和而导致药物浓度无法抑制某些细菌生长。

（5）肠道菌群的代谢功能，陈怀侠[5]（2007）等采用液质联用技术对阿托品在大鼠肠道菌群中的代谢产物进行了研究，发现了9种阿托品肠道菌群代谢产物，如脱水阿托品、脱品和脱品酸。药物进入消化道后，可通过消化道内细菌的代谢活化使之具备强大的药理活性[6]，从而发挥更好疗效，对某些细菌抑制作用加强。

无论是胃内细菌增多或减少，结果表明泰万菌素作用下，对胃肠道产生了一定影响，但未造成不可逆损伤，且停药后胃内菌群结构有恢复到原来状态的趋势。这预示着在养殖生产上合理使用泰万菌素是安全的，但若过量使用可能会导致肠道菌群失衡，产生耐药性细菌，故用药时应谨慎。

本实验采用的DGGE技术克服了微生物难培养或不可培养两方面的局限，不仅具有可大量检测、能与其他方法结合使用等优点，其在揭示自然界微生物多样性方面具有独特的优越性。

[1]陈凤.口服抗生素改变大鼠肠道菌群和大脑海马脑源性神经营养因子的表达及其恢复[D].辽宁：大连医科大学,2015：13.

[2]李喆宇,崔玉彬,张静霞,等.大环内酯类抗生素的研究新进展[J].国外医药（抗生素分册）,2013,34(1)：6-15.

[3]朱小翠.断奶仔猪胃肠道乳酸菌与芽孢杆菌分离鉴定及其生物学特性研究[D].南京：南京农业大学,2012：4-7.

[4]周秀锦,张静,林维宣,等.质谱检测泰乐菌素的方法研究进展[J].安徽农业科学,2016,44(23)：31-34.

[5]陈怀侠,陈勇,韩凤梅,等.电喷雾串联质谱法分析阿托品及其代谢物[J]．分析化学,2007,35(1)：61-65.

[6]张照楠,陈瑞雪,王跃飞,等.药物与肠道菌群的相互作用[J].中药材,2015,38(6)：1319-1323.

S859.796

A

1006-4907（2017）04-0033-03

10.3969/j.issn.1006-4907.2017.04.017

2017-07-17

周应培（1981～），男，汉族，湖南宁乡人，助理兽医师，主要从事动物疫病的防控和研究，E-mail：779977588@.com。