LAMP和Xpert Mtb/RIF早期诊断肺结核传染源的价值比较

张伟阳，钟建平，杨国彪，金法祥，许文芳，王华钧

（绍兴市立医院，浙江绍兴 312000，1.感染科；2.检验科）

·临 床 经 验·

LAMP和Xpert Mtb/RIF早期诊断肺结核传染源的价值比较

张伟阳1，钟建平1，杨国彪1，金法祥2，许文芳2，王华钧1

（绍兴市立医院，浙江绍兴 312000，1.感染科；2.检验科）

目的：评价DNA环介导恒温扩增（LAMP）技术和Xpert Mtb/RIF早期发现肺结核传染源的临床应用价值。方法：采用Xpert Mtb/RIF检测试剂盒、MGIT液体培养和LAMP技术对肺结核300份痰液标本进行检测，其中涂阳标本100例。结果：肺结核涂阳标本100例，LAMP技术检测结核分枝杆菌（MTB），阳性96例，阳性率为96.0%，Xpert Mtb/RIF检测MTB，阳性97例，阳性率为97.0%，涂阳标本2种方法检测结果差异无统计学意义（P＞0.05）。涂阴标本200例，LAMP技术检测MTB，阳性107例，阳性率为53.5%，Xpert Mtb/RIF检测MTB，阳性50例，阳性率为25.0%，涂阴标本2种方法检测结果差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：在诊断肺结核涂阳标本时，LAMP技术与Xpert Mtb/RIF的敏感性相似；诊断涂阴标本时，LAMP技术优于Xpert Mtb/RIF。

抗酸杆菌；结核分枝杆菌；核酸扩增技术；诊断

结核病严重危害人类健康。近10年来，由于艾滋病的流行、移民和流动人口的增加、耐多药结核杆菌的增多，以及不少国家和地区对结核病控制的忽视等因素，全球结核病形势急剧恶化[1]。结核病是由结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染病，早期发现活动性肺结核传染源是预防和控制结核病传播的重要措施之一。本研究采用DNA环介导恒温扩增试验（loopmediatedisothermalamplifyication，LAMP）技术及XpertMtb/RIF试剂盒对MTB进行检测，并与MGIT液体培养法比较各检测法的应用价值。

1 材料和方法

1.1 标本来源标本均来自我院2014年住院诊断为肺结核病的患者（男195例，女105例，平均年龄43.7岁），每人送检一份合格痰标本，共300份，其中涂阳标本100例，涂阴标本200例。

1.2 试剂与仪器LAMP试剂（广州华峰生物科技有限公司），GeneXpertMtb/RIF检测仪及试剂盒（美国Cepheid公司），显微镜（日本奥林巴斯株式会社），低温高速离心机（美国ThermoFisherScientific公司），生物安全柜（美国Nuaire公司）。

1.3 分枝杆菌菌株14株非MTB（包括胞内分枝杆菌5株、鸟分枝杆菌3株、脓肿分枝杆菌1株、瘰疬分枝杆菌1株、堪萨斯分枝杆菌2株、海分枝杆菌1株、偶发分枝杆菌1株），均为本院临床分离株，通过DNA微阵列芯片法进行菌种鉴定；H37RvMTB标准株1株来自浙江省结核病防治研究所。

1.4 检验方法每份痰标本同时进行MGIT液体培养、XpertMtb/RIF检测及LAMP技术检测。

1.5 MGIT液体培养采用N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠（NALC-NaOH）处理中和离心法培养MTB。

1.6 LAMP技术

1.6.1 DNA制备：根据痰液标本量，加入2倍体积4%NaOH溶液，充分混匀，室温静置液化30min；吸取1mL液化液加入无菌1.5mL离心管中，15000r/min离心5min，弃上清；沉淀用1mL0.9%氯化钠溶液洗涤，15000r/min离心5min，弃上清，沉淀用1mL0.9%氯化钠溶液重悬洗涤，15000r/min离心5min，弃上清，沉淀用于模板提取；分别加入100μLDNA提取液I和0.25μLProteinaseK，56℃温浴30min，再沸水浴10min；加入12.5μLDNA提取液I I，混匀，12000r/min离心5min，上清即为DNA模板。

1.6.2 核酸扩增：取出HF管于室温解冻。向上述反应管内按顺序分别加入阴性对照、待检模板和阳性对照各2.5μL；置65℃恒温反应60min。反应结束，将HF管倒置甩动2次，再正置甩动2次，使工作液与显色液充分混合，冷却至室温后观察。

1.6.3 结果判读：待检标本反应管液体呈绿色，结果为MTB阳性；待检标本反应管液体呈橙色，则报告MTB检验结果为阴性。

1.7 Xpert Mtb/RIF检测检测试剂由美国Cepheid公司研发，PCR检测所需的3个步骤（DNA提取、扩增和检测）自动化，WHO于2010年批准了该法的应用，按试剂说明书操作。

1.8 统计学处理方法率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP和Xpert Mtb/RIF检测结果涂阳标本100例，LAMP检测MTB阳性率为96.0%，XpertMtb/ RIF检测MTB阳性率为97.0%，2种方法检测结果差异无统计学意义（χ2=0.15，P＞0.05），见表1。

表1 涂阳标本检测MTB结果

涂阴标本200例，LAMP检测MTB阳性率为53.5%，XpertMtb/RIF检测MTB阳性率为25.0%，2种方法检测结果差异有统计学意义（χ2=34.1，P＜0.01），见表2。

表2 涂阴标本检测MTB结果

涂阴标本200例，LAMP技术检测MTB的阳性率与MGIT液体培养法比较，差异有统计学意义（χ2=42.2，P＜0.01）；XpertMtb/RIF检测与MGIT液体培养法比较，差异无统计学意义（χ2=0.5，P＞0.05）。

2.2 非MTB检测结果LAMP技术和XpertMtb/RIF检测14株非MTB（胞内分枝杆菌5株，鸟分枝杆菌3株，脓肿分枝杆菌1株，瘰疬分枝杆菌1株，堪萨斯分枝杆菌2株，海分枝杆菌1株，偶发分枝杆菌1株），结果均未检出。XpertMtb/RIF检测MTBH37Rv标准株，结果MTB阳性，利福平耐药基因rpoB未检测到突变结果，即对利福平敏感；LAMP技术检测MTBH37Rv标准株，结果阳性。

2.3 LAMP技术检测结果300例痰液标本，阳性203例，阳性率为67.7%，检测结果肉眼判断，没有靶序列DNA的则为橙色，含有靶序列DNA管中有大量的LAMP扩增产物而显绿色，结果观察见图1。

3 讨论

图1 LAMP技术检测结果（绿色为阳性，橙色为阴性）

结核病细菌学检查是发现结核病传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据[2]。痰涂片染色法临床中应用最普遍，但敏感性低，漏检率较高，且无法区分MTB和非MTB，也不能确定菌体是活菌还是死菌。随着分子生物学技术的发展，建立在核酸扩增基础上的检测法推动更多科学研究，全球已经开发了多种新型的结核病实验室诊断新技术，其中LAMP技术反应2h即可完成核酸扩增，通过目测可以得到清晰的结果，不需要长时间的循环温度，不需要PCR等昂贵的仪器，仅需要一恒温设备，检测成本大大降低。XpertMtb/RIF是WHO推荐的一种全新的结核病快速检测方法，其采用荧光定量核酸扩增技术，检测MTB利福平耐药基因rpoB的81bp耐药核心区是否发生突变，从而判断受检菌株是否对利福平耐药。该检测系统所需试剂价格昂贵，在结核病高发的发展中国家，其广泛应用还存在困难。本研究结果显示，XpertMtb/RIF检测阳性147例，阳性率为49.0%，LAMP检测阳性率为67.7%，明显高于MGIT液体培养法，这与国内外文献[3-6]报道基本一致。

综上所述，在诊断肺结核涂阳标本时，LAMP技术与XpertMtb/RIF的敏感性相似；诊断肺结核涂阴标本，LAMP技术优于XpertMtb/RIF，且具有试剂成本低的优势。LAMP技术检测过程仅需2h，能早期诊断和鉴别诊断肺结核，预防非耐药结核病进一步转变为耐药结核病，阻止和减少耐药MTB在社区中的播散。因此，LAMP技术是一种简便、快速、灵敏度高的结核分枝杆菌检测技术。

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[3] 金法祥, 王华钧, 孙小军. DNA环介导恒温扩增试验检测结核分枝杆菌的研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2011, 21 (12): 2639-2640.

[4] IWAMOTO T, SONOBE T, HAYASHI K. Loop-mediated isothermal amplification for direct of mycobacterium tuberculosis complex, M.avium, and M.intracellulare in sputum samples[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(6)∶ 2616-2666.

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（本文编辑：丁敏娇）

Clinical application of LAMP and Xpert Mtb/RIF in early detection of pulmonary tuberculosis infection

ZHANG Weiyang1, ZHONG Jianping1, YANG Guobiao1, JIN Faxiang2, XU Wenfang2, WANG Huajun1. 1.Department of Infectious Diseases, Shaoxing Municipal Hospital, Shaoxing, 312000; 2.Department of Clinical Laboratory, Shaoxing Municipal Hospital, Shaoxing, 312000

Objective:To compare the clinical application of DNA loop mediated isothermal amplifcation (LAMP) technology and Xpert MTB/RIF in early detection of the infectious source of pulmonary tuberculosis.Methods:Three hundred TB sputum samples were detected using Xpert Mtb/RIF detection, MGIT liquid culture and LAMP technology, of which 100 cases of smear-positive specimens, 200 cases of smear-negative specimens.Results:In 100 cases of TB smear-positive specimens, the positive rate was 96.0% with LAMP technology, and the positive rate was 97.0% with Xpert Mtb/RIF detection (P＞0.05). In 200 cases of smear-negative specimens, the positive rate was 53.5% with LAMP technology, and the positive rate was 25.0% with Xpert Mtb/RIF detection (P＜0.01).Conclusion:In the diagnosis of smear positive specimens, the sensitivity of LAMP technology and Mtb RIF/Xpert was similar. In the diagnosis of smear negative specimens, LAMP technology is better than Mtb Xpert/RIF.

acid fast bacilli; mycobacterium tuberculosis; nucleic acid amplifcation techniques; diagnosis

R446.5

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.013

2016-05-31

绍兴市卫生计生科技计划成果转化项目（2016ZH003）。

张伟阳（1965-），男，浙江新昌人，主任医师。

金法祥，主任技师，Email：sxjfx0575@126.com。