人辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶在宫颈癌中的研究进展

邓田园综述周瑾第一审校张艺峰第二审校

(1.新疆军区总医院妇产科，新疆乌鲁木齐830000；2.石河子大学医学院，新疆石河子832000；3.新余市妇幼保健院妇产科，江西新余338000)

人辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶在宫颈癌中的研究进展

邓田园1，2综述周瑾1第一审校张艺峰3第二审校

(1.新疆军区总医院妇产科，新疆乌鲁木齐830000；2.石河子大学医学院，新疆石河子832000；3.新余市妇幼保健院妇产科，江西新余338000)

视黄酸(rRA)是维生素A的活性代谢产物，在胚胎发育和细胞的生长及分化过程中发挥重要作用。视黄酸相关物质与肿瘤细胞的分化、增殖或凋亡等密切相关。作为视黄酸代谢酶的一种，人辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)被证实了其剪接的异常及蛋白酶活性变化和宫颈鳞状细胞癌的发生和发展密切相关。本文，我们将详述NRDR的研究现状和未来前景。

维甲酸；人辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶；宫颈癌

宫颈癌(cervical carcinoma)是一种常见的恶性妇科肿瘤，严重威胁妇女生命健康，其危险因素除了高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染，机体基因易感性也参与了它的发生，有研究指出宫颈癌对妇女的危害在发展中国家更加显著[1]。人辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶[NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase，NRDR]是一种维甲酸(retinoic acid，RA)代谢酶，有研究结果表明，宫颈鳞癌的发生发展与NRDR选择性剪接的异常及其蛋白酶活性的改变关系紧密；并且癌蛋白E6E7发生降解过程中，NRDR、Hsp70与HPVE6E7之间的相互作用发挥了一定的促进作用，这可能是NRDR影响宫颈癌发生的机制之一，因此备受关注。

1 维甲酸代谢酶NRDR

视黄酸，又称维甲酸、异维A酸，是动物体内维生素A的代谢中间产物。分子式：C20H28O2，分子量300.44，CAS号302-79-4，熔点180℃。它具有广泛的生理学及药理学活性，是维生素A的生物活性代谢产物，诸多的研究表明，其具有调控特定上皮细胞的分化、抑制肿瘤的发生等作用[2]。在维甲酸的体内合成过程中，必经的步骤—视黄醇到视黄醛再到视黄酸，关键部位即视黄醇到视黄醛的转化过程。基于该过程的研究中，Napoli等[3]在动物肝脏微粒体内发现了能分解视黄醇生成视黄醛的NADP依赖型酶类，其属于短链脱氢还原酶超家族(SDR)，且此酶及其同工酶在催化过程中起着限速作用。

NRDR是Sierra-Torres等[4]首先从兔肝中发现并纯化的一种维甲酸(retinoic acid，RA)代谢酶，于各种哺乳动物肝脏组织中均有分布，具有调节体内环境维甲酸的合成与代谢的作用。NRDR在生理条件下具有RA还原活性，且该作用较已知的短链脱氢酶家族(SDR)其他成员更强。这使得前一阶段各方面对NRDR的研究骤然增多。

2 NRDR于肿瘤方面研究现状

流行病学研究发现证实：摄入的维生素A的量或其于血浆的浓度与多种癌症如乳腺癌、肺癌、肝癌等的发生呈反比关系。最近杨清远等[5]通过对其2009-2012年收集的食管癌患者病理标本的提取，通过RT-PCR等过程分析后指出：细胞视黄酸结合蛋白2 (CRABP2)在相关抑癌基因的下调、肿瘤的分化、TNM分期及转移中都存在重要作用。该实验通过直接的流式细胞分析得到结论，且结论涉及肿瘤分化、TNM分期等，结果可信度稍差，实验分组及标本纳入标准方面值得再推敲，但总体结论是与当前主流研究相符，在一定程度上证实了维甲酸的抗癌作用；刘红等[6]通过建立肺癌移植瘤动物模型实验后认为：(1)全反式维甲酸与顺铂都有抑制肺癌A549细胞裸鼠移植瘤生长，促进移植瘤细胞凋亡的作用，但二者联合作用效果相比较更加突出。(2)二者对肿瘤细胞的抑制作用可能与抑制bcl-2基因表达下调同时促进bax基因表达上调，及bcl-2基因抑制细胞的增殖和bax基因促进细胞的凋亡有关联。该实验分组情况好，各病理类型明确，对照完备，虽为动物模型实验，亦存一定指导意义。相似情况于国内外研究中均可见到，如Castillo等[7]提出的对与甲状腺癌的类似抑制作用、崔洁等[8]对肝癌模型的研究指出：ATRA(全反式维甲酸)可抑制肿瘤细胞Hepa1-6增殖，并具有浓度依赖性，促进其凋亡，干扰其迁移及侵袭能力，这与抑制细胞的间质表型及ATRA上调MicroRNA200家族密切相关。NRDR作为有更强还原性的RA代谢酶，与之关系较密切的肿瘤却是宫颈癌。

3 NRDR在宫颈癌中的研究进展

Cervical Carcinoma是妇科三大恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高，发病年龄逐渐年轻化，尤其在25～34岁年龄组发病率上升明显。宫颈癌前病变及宫颈癌变的重要因素在临床广泛认可的是持续性的高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染，但HPV感染并不是引起宫颈癌的唯一因素[9]。很多与宫颈癌发病相关因素的研究逐渐增多，其中有关的基因研究已成为一个热点，多项研究表明宫颈癌的发病与基因的变异所引发的一系列改变有关。有研究结果表明，宫颈鳞癌的发生发展与NRDR选择性剪接的异常及其蛋白酶活性的改变关系紧密；并且NRDR、Hsp70与HPVE6、E7之间相互作用并促使癌蛋白E6、E7发生降解，可能是NRDR影响宫颈癌发生的机制之一[10-11]。Helm等[12]通过对CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ的病变患者外源性应用NRDR类物质，借此来观察病变转归情况，从而得到结果：此类物质的应用对于CINⅡ转归为低阶病变甚至正常组织效果较为明显，对于CINⅠ样本数及其他干扰因素所致的结论信服力足，而在CINⅢ的转归方面，维甲酸代谢酶类无明显作用。这从侧面证明了NRDR类物质对于宫颈的肿瘤防治作用，而之所以对CINⅢ的转归效果较差，原因可能在于病变组织内部NRDR新的剪接亚型过表达对外源性类似物质的抑制作用所致。实际情况，在HPV感染基础上，是不是会增加宫颈癌对相关某些暴露的易感性，这本身就值得进一步商榷。黄东阳等[13]实验发现NRDR的异常选择性剪接、新剪接亚型NRDRB1细胞内定位及蛋白酶活性的改变在宫颈癌的发生与发展中可能发挥重要作用，此猜想依托大量严谨实验，有一定可信度，较仅凭猜想得来的结论更具说服力。

黄东阳等[13]、刘戈飞等[13-15]实验团队通过前期实验的基础准备，完成了NRDR的测序及不同剪接亚型的制备，同时完成了NRDR多克隆抗体的制备及纯化，为后期的实验顺利进行打下基础。随后宋旭红等[16]通过RT-PCR等方法检测宫颈癌组织中NRDR、NRDRB1表达，用RACE法克隆NRDRB1全长cDNA，运用Gateway表达系统将NRDR、NRDRB1编码区序列构建到表达载体，转化到大肠杆菌中表达，表达的融合蛋白通过金属离子亲和层析纯化，在大肠杆菌中获得高效表达的NRDR、NRDRB1蛋白。而后又以pDONR-NRDR、pDONR-NRDRB1载体为模板，用PCR方法扩增两端带有酶切位点的NRDR及NRDRB1编码区序列，随后将其与真核表达载体(pCDNA3、pCMV-Myc)连接。酶切后测序鉴定,并转染于HeLa细胞，通过Western blot、蛋白质谱分析检测及鉴定表达蛋白。籍此成功构建NRDR、NRDRB1真核表达载体，转染HeLa细胞后可表达带有Myc标签的蛋白和不带标签的Native蛋白；质谱分析结果证实所表达的蛋白为NRDR和NRDRB1。依次获得了在原核及真核细胞中表达的NRDR、NRDRB1蛋白，为揭示NRDR于人体内参与维甲酸代谢的论证提供了物质基础。然而宋旭红等[17]随即发现：真核构建所表达出的NRDR蛋白活性相对较低的情况又使此研究蒙上新的面纱。考虑到体内参与维甲酸代谢酶较多，机制相对复杂，得到活性稍低的NRDR蛋白却也可以被接受。张红丽等[18]通过对与宫颈癌相关的维甲酸受体β2进行研究指出该受体表达沉默与宫颈癌的发病相关，同时该受体的表达恢复能增加机体的抗肿瘤能力，从而引发了以维甲酸相关基因做靶点的抗癌思路。近日多项针对于民族之间宫颈癌患者NRDR表达水平差异的研究正在开展，作为整体的一部分，这将对NRDR之于宫颈癌的全面研究提供助力，为研究工作提出了新思路。

4 展望

视黄酸类衍生物在预防和治疗恶性肿瘤上取得了瞩目的进展。目前视黄酸类衍生药物Targretin (LGD1069)在医学发展中已取得明显效果，尤其在皮肤病和癌症的治疗中。然而在临床应用上，大部分视黄酸类药物的治疗剂量与药物的中毒剂量很接近，此缺陷对于视黄酸类药物的进一步临床应用有一定的限制[19]，或许相关研究的进一步展开有可能解决此类问题。而NRDR之于宫颈癌，我们有理由相信二者之间的关联并非空穴来风。如能确切利用实时荧光定量PCR、反转录PCR、限制性片段长度多态性(RFLP)和Western Blot等技术检测NRDR基因在宫颈癌患者和对照人群中的变异和表达水平等，分析NRDR基因变异与表达水平的相关性，相信作为一种早期筛查手段，则会使宫颈病变更早期发现，更早期治疗，实现病变的癌前终结；作为一种治疗手段，将通过单克隆抗体的制备，通过靶向治疗减轻宫颈癌患者的痛苦[20]。NRDR相关研究需更进一步，不久的将来如能实现对宫颈癌患者NRDR基因启动子区SNP及NRDR基因表达变化的检测，同时分析NRDR基因变异与表达的水平，这将使宫颈癌高危人群的识别、预防及诊断工作更上一台阶。

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Research and progress of NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase in cervical carcinoma.

DENG Tian-yuan1,2,ZHOU Jin1,ZHANG Yi-feng3.1.Department of Gynaecology and Obstetrics,Xinjiang Military General Hospital,Urumqi 830000,Xinjiang,CHINA;2.Shihezi University School of Medicine,Shihezi 832000,Xinjiang,CHINA; 3.Department of Gynaecology and Obstetrics,Maternal and Child Health Care Hospital of Xinyu,Xinyu 338000,Jiangxi, CHINA

Retinoic acid(RA)is an active derivative of vitamin A,which plays an important role in embryonic development,cell growth and differentiation through regulating the target gene expression.Current studies have found that the RA related substances are closely related to the differentiation,proliferation and apoptosis of tumor cells.As a kind of retinoic acid metabolism enzyme,NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase(NRDR)was proved that its abnormal splicing and protease activity changes are closely related to the occurrence and development of cervical squamous cell carcinoma.In this review,we will discuss the research status and future prospects of NRDR.

Retinoic acid(RA);NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase;Cervical carcinoma

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.028

R737.33

A

1003—6350（2017）15—2502—03

2016-11-29)

新疆维吾尔自治区自然科学基金(编号：2015211C245)

周瑾。E-mail：zhoujin92629@163.com