嵌合抗原受体修饰T细胞治疗恶性淋巴瘤研究进展

蒋婷，纪青，邓飞

(遵义医学院病理学教研室，贵州 遵义 563000)

·综 述·

嵌合抗原受体修饰T细胞治疗恶性淋巴瘤研究进展

蒋婷，纪青，邓飞

(遵义医学院病理学教研室，贵州 遵义 563000)

恶性淋巴瘤(ML)是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，现有的常规治疗手段主要为化疗和放疗，但不良反应较大，疗效欠佳。嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)疗法是近年来治疗恶性肿瘤的一种新模式，在淋巴造血系统肿瘤治疗上显示了良好的抗肿瘤效应，但CAR-T细胞也会杀伤带有CAR相对应抗原的正常细胞，产生细胞因子风暴等副作用。本文从CAR原理及结构及其在ML中的临床应用和不良反应等方面作简要综述。

嵌合抗原受体；T细胞；恶性淋巴瘤；进展

恶性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，根据其病理、临床特点及预后转归等分为非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)和霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma，HL)。现有的常规治疗手段主要为化疗和放疗，但不良反应较大，疗效欠佳即完全缓解率低或复发率高，例如HL虽化疗后完全缓解率可达70%～80%，但20%～30%的患者对化疗方案原发耐受，且其中4%～50%的患者常有预后不良伴复发[1]。因此，寻找一种毒副作用小、特异性强且安全有效的治疗方法十分必要。嵌合抗原受体修饰T细胞(chimeric antigen receptor modified T cells，CAR-T)疗法是目前最具前景的肿瘤治疗方法之一，CAR-T细胞通过抗原、抗体结合的原理特异性识别肿瘤细胞表面抗原，可不受肿瘤局部微环境免疫抑制、以非MHC限制性的方式特异性杀伤肿瘤细胞，相比以往的免疫治疗手段有着更好的肿瘤特异性，更加高效的攻击效应及攻击持久性[2]。近年来，CAR-T疗法在恶性肿瘤，特别是淋巴造血系统肿瘤治疗上显示了良好的抗肿瘤效应[3]。

1 CAR-T作用原理

CAR-T是通过人工手段，将识别肿瘤相关抗原的单克隆抗体序列(single chain variable fragment，scFv)和T细胞的活化序列在体外进行基因重组，形成重组质粒，通过病毒载体、电穿孔、转座子系统等转染技术在体外转染、纯化、扩增后回输到患者体内，这种经过基因改造和修饰后的T细胞称为CAR-T细胞。CAR-T细胞能在体内及体外特异性识别肿瘤细胞表面抗原，在与目的抗原结合后直接介导细胞毒性，通过释放颗粒素、穿孔酶、干扰素(IFN)和肿瘤坏死因子(TNF)等达到杀伤肿瘤细胞的目的。

2 CAR-T结构

CAR-T细胞由胞外抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号肽区组成。胞外区为单克隆抗体的单链可变区scFv段，可变区序列能够识别特定肿瘤抗原，目前已有多种肿瘤抗原可用作胞外区识别，包括CD19、CD20、CD30、表皮生长因子受体(VEGFR)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、人类表皮生长因子受体-2、CEA、GD2、碳酸酐酶Ⅸ等[4]。当scFv与这些肿瘤抗原结合，可通过TCRζ(CD3ζ)或Fc受体的胞内区使T细胞活化发挥效应功能；跨膜区连接胞外与胞内区，由同源或异源二聚体膜蛋白组成，常用的CAR跨膜区分子有CD3、CD4、CD7、CD8、CD28、4-1BB (CD137)、OX40(CD134)、DAP-10等；胞内区具有免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，最常见的是T细胞受体TCR/CD3ζ链和免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，主要负责信号转导功能。

根据CAR胞内信号区的结构不同将其分为三代。一代CAR由肿瘤相关抗原的单链抗体(scFv)和ITAM构成，不含共刺激分子，能够识别靶抗原并激活T细胞，但不转导增殖信号和诱导细胞因子产生，杀伤作用有限。于是在此基础上构建了二代CAR和三代CAR，它们结构上的区别在于：分别嵌入了一种或者多种来源于 CD28、4-1BB、OX40、DAP10、ICOS、CD27的胞内共刺激分子信号结构域，构建的这种二代CAR和三代CAR与一代CAR相比促进T细胞增殖效能更好、释放细胞因子的水平更高、抗肿瘤效能更强[5-6]，但其改进的作用效果如何仍需要进一步验证。

3 CAR-T在ML治疗中的应用

目前临床上应用针对ML的CAR种类很多，主要包括构建靶向CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD123、Kappa轻链等抗体的CAR来修饰外周血T细胞进行临床试验和研究[7]。

2011年，Savoldo等[8]首次报道将靶向CD30的CAR负载于EB病毒特异性细胞毒性T细胞(EBV-CTLs)制备了CD30 CAR+)EBV-CTLs，该细胞能够在HL SCID小鼠移植瘤模型中发挥抗肿瘤作用。2012年，Till等[9]应用靶向CD20分子，共刺激分子包括CD28和4-1BB (CD137)的第3代CAR-T细胞治疗3例套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma，MCL)和1例滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)患者，回输细胞前均予以淋巴细胞清除，输注后第14天输入IL-2，其中1例MCL患者达完全缓解，另外两例持续无疾病进展期分别达12个月和24个月，FL总体上呈部分缓解。

相比之下，应用靶向CD19的CAR-T细胞治疗NHL患者的疗效尤为突出[10-12]，2013年，Kochenderfer等[13]报道了采用异基因第2代抗CD19-CAR-T细胞治疗10例B细胞淋巴瘤患者，患者在输注细胞前未接受放疗或化疗处理，输注细胞后不给予IL-2，CAR-T细胞在7～14 d达峰值，持续时间不超过1个月，大多数病情稳定，其中1例缓解期维持达32个月，但所有患者在输注细胞后出现了短暂的发热、低血压、乏力等反应且均在两周之内缓解。2015年Kochenderfer等[14]再次将抗CD19-CAR-T细胞应用于B细胞淋巴瘤患者，总体均获得部分缓解。与此同时，Schuster等[15]应用靶向CD19的CAR-T细胞免疫治疗复发/难治性NHL患者的Ⅱa期临床试验，总反应率达67%(其中12例DLBCL患者的反应率为50%，6例FL患者反应率则为100%)，中位随访6个月患者的无进展生存率为59%，其良好的抗肿瘤效应，证明了CAR-T用来治疗难治性恶性淋巴瘤的可行性和有效性，为CAR-T细胞免疫治疗的进一步发展提供了强有力的支撑。

4 CAR-T细胞免疫治疗的主要不良反应及解决途径

这些由不同研究小组已经发表的临床试验数据均证实CAR-T用来治疗难治性ML的可行性和有效性，但治疗过程中引起的不良反应亦不能忽视，主要包括细胞因子释放综合征、脱靶效应、插入突变、移植物抗宿主反应等。

4.1 细胞因子释放综合征(cytokine relaease syndrome，CRS)CAR-T细胞治疗过程中出现的首要不良反应是CRS，临床主要表现为发热、心动过速、低血压、急性呼吸窘迫综合征或多器官功能衰竭，严重者可危及患者生命[17]。这与大量激活的T细胞介导的急性抗肿瘤反应有关，肿瘤细胞在短时间内被溶解消散的同时会启动一系列细胞因子的释放，如IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α等。目前主要通过以下措施预防和减少CRS的发生：(1)低剂量多次回输CAR-T细胞；(2)先培养回输第1代CAR-T细胞，待患者适应后，再改用第2代或第3代CAR-T细胞；(3)在CAR中导入自杀基因以控制T细胞的过度增殖[17]；(4)适当使用类固醇激素及免疫抑制剂拮抗剂缓解CRS症状。(5) CRS的严重程度与肿瘤负荷呈正相关，通过化疗或者放疗预处理减小肿瘤负荷，可提高CAR-T细胞的抗肿瘤效应并在一定程度上降低CRS反应。

4.2 脱靶效应 CAR针对肿瘤细胞表面的特异性抗原很少，大多为肿瘤相关性抗原，因此，CAR-T细胞靶向性杀灭肿瘤细胞的同时也会对带有CAR相对应抗原的正常细胞产生杀伤，称之为脱靶效应。Kochenderfer等[18]报道了1例抗CD19-CAR治疗B细胞淋巴瘤病例，观察发现在持续清除外周血B细胞达39周后患者才出现CD19+淋巴瘤细胞清除效果，表明脱靶效应的存在直接影响了CAR-T疗法的抗肿瘤疗效。现阶段处理方案：(1)选择特异性更高的肿瘤相关抗原；(2)构建能够同时识别和结合肿瘤细胞表面一种以上抗原的CAR，因为正常细胞只表达一种抗原可避免受到损伤[19]；(3)根据靶抗原表达水平,设计与靶抗原有特定亲和力的CAR；(4)构建跨信号CAR，不直接相连CAR结构中的T细胞活化信号CD3ζ与共刺激信号CD28分子[20]；(4)对于B细胞缺乏，可通过输注丙种球蛋白纠正[21]。

4.3 插入突变 CAR技术是将外源性基因序列整合到正常T细胞内，理论上正常T细胞存在一定的基因突变风险，目前尚未有相关报道，但有研究中心采用mRNA直接转导T细胞的办法以避免该风险。

4.4 移植物抗宿主反应(graft versus host disease，GVHD)CAR-T细胞在患者体内长期存在可能会引起GVHD样损伤，为减少GVHD的发生Hoyos等[22]的策略是在设计CAR-T细胞的同时整合入自杀基因如Caspase-9，通过化学诱导等方法启动CAR-T细胞的自杀程序。且有研究表明通过给异基因造血干细胞移植后的患者输注特异性细胞毒性T淋巴细胞并无GVHD的产生[23]，所有这些研究为CAR-T细胞技术用于预防GVHD的发生提供了新的思路。

5 结 语

众多研究表明CAR-T细胞技术的问世明显改变着ML的治疗模式且有着广阔的应用前景，然而CAR-T细胞在治疗不同类型肿瘤时会表现出不同的作用效果，而且在攻击肿瘤相关抗原的同时也会攻击正常细胞和组织，由此引发的各种不良反应不容忽视。目前国外通常的做法是选用不同的单链抗体序列，寻找高水平表达的肿瘤相关抗原，或低剂量多次回输等方法加以解决，但现有的临床数据大都是小样本研究，CAR-T治疗方法在技术和大规模临床应用方面仍然存在着巨大的挑战。因此需要更多实验数据和临床数据来证实这一新治疗策略的安全性和有效性，相信随着研究的深入和技术的不断改进，CAR-T细胞免疫治疗将会为更多的肿瘤患者带来福音。

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Research progress of chimeric antigen receptor modified T cells in malignant lymphoma.

JIANG Ting,JI Qing, DENG Fei.Department of Pathology,Zunyi Medical College,Zunyi 563000,Guizhou,CHINA

Malignant lymphoma(ML)is a malignant tumor originating in the lymphoid hematopoietic system. Current conventional treatment methods to ML are mainly chemotherapy and radiotherapy,but they both cause many adverse reactions,and the therapeutic efficacy is unsatisfactory.The modified chimeric antigen receptor T cells(CAR-T) therapy is a kind of new pattern of malignant tumor therapy in recent years.It shows great effect on lymphatic hematopoietic system,but CAR-T cells will also kill the normal cells that wearing CAR antigen,which can cause cytokine storm and other risks.In this review,CAR principle and its structure,and its clinical use and existing problems in malignant lymphoma treatment are summarized.

Chimeric antigen receptor;T cells;Malignant lymphoma;Progress

R733.4

A

1003-6350（2017）04-0612-03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.04.031

2016-09-01)

国家自然科学基金(编号：81160300)

邓飞。E-mail：mdproffeideng@hotmail.com