何首乌药材及常见伪品的真伪鉴别方法研究

何首乌是常见的补益中药，它是蓼科植物何首乌的干燥块根，有很好的通便、润肠、截疟、消痈、解毒等作用，通过将何首乌炮制加工，更是有可化浊降脂、强筋骨、乌须发、益精血、补肝肾等效果[1-2]。但经调查发现，索骨丹、头花千金藤、白首乌、毛脉蓼、翼蓼很容易和何首乌混伪，给制何首乌和何首乌饮片带来严重影响，对此有很多研究者通过各种方法来区分、鉴别，如分子生药学、近红外光谱、高效液相色谱、高效液相色谱、显微鉴别、性状特征[3-6]，但鲜有文献报道通过液相色谱特征图谱和系统的薄层色谱鉴别方法。本研究就通过液相色谱特征图谱和系统的薄层色谱来比较分析，皆在为何首乌药材和饮片的真伪鉴别提供参考，现将报道如下。

1 试药与仪器

1.1 试药

何首乌和制何首乌药材及饮片均来源于市场抽样，翼蓼、毛脉蓼、索骨丹、头花千金藤、白首乌均来源于市场；水为超纯水，甲醇和乙腈都是色谱纯；大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷对照品、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷对照品由成都曼思特生物科技有限公司提供；制何首乌对照药材、何首乌对照药材、大黄素甲醚对照品、大黄素对照品、虎杖苷对照品、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 仪器

高效液相色谱仪（美国waters公司，型号：2695/2487）；薄层色谱数码成像系统（瑞士卡玛公司，型号：TLCVISU ALIZER）；薄层点样仪（瑞士卡玛公司，型号：CAMAG automatic TLC sampler 4）；电子分析天平（德国赛多利斯公司，型号：SECURA213-1CN）。

2 方法

2.1 性状鉴别

何首乌最显著的性状特征就是云锦花纹，但若经过炮制，其性状会变化，最明显的就是转为黑褐色，所以如果用炮制前的特征来鉴别就不明显，容易被其他类似品冒充[7]。若何首乌是正品，在炮制后的块片就是不规则皱缩状，凹凸不平，但质坚硬，表面棕褐色或黑褐色，大约厚1 cm，断面角质样，断面为黑色或棕褐色，气微，味微甘伴苦，见图1-1。本次专项检验发现，可以将性状不合格的制何首乌分为2类：（1）不规则略皱缩状块片，很薄，大约厚0.3 cm，断面一般角质不明显，气微，微甘略苦，见图1-2；（2）不规则略皱缩状块片，黑褐色，大小不一，凹凸不平，断面无角质，气微，味淡，见图1-3和1-4。

图1 制何首乌性状图

2.2 高效液相色谱特征图谱

2.2.1 液相色谱条件 色谱条件：Waters Xbridge C18色谱柱；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱；流速：1.0ml/min；进样量：10 μl；柱温：30℃；检测波长：254 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 称取6.73mg大黄素甲醚对照品，6.30mg大黄素对照品，5.43mg大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷，5.64mg大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷，7.43mg 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，放入50ml的量瓶，再加入甲醇进行溶解，摇匀。

2.2.3 供试品溶液的制备 取适量供试品药材进行粉碎，再过4号筛，称取1 g供试品粉末，放入三角瓶，再加入50ml甲醇，80℃加热回流1 h，过滤再蒸干，将滤液当作供试品溶液。

2.3 薄层色谱鉴别

2.3.1 薄层色谱条件 固定相：以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G；展开溶剂：甲醇和三氯甲烷以3∶7比例展至6 cm，晾干，再以1∶20比例为展开剂，展至7 cm，晾干；检视条件：紫外光灯下检视。

2.3.2 对照品及对照药材溶液的制备 对照品溶液制备：分别取大黄素甲醚对照品、大黄素对照品、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，再分别加入甲醇制成1mg/ml的溶液。对照药材溶液制备：取0.25 g制何首乌对照药材或者何首乌，加入50ml乙醇，加热回流1 h，滤液浓缩到3ml。

2.3.3 供试品溶液的制备 取0.25 g供试品粉末，再加入50ml乙醇，加热回流1 h，滤液浓缩到3ml。

3 结果

3.1 薄层色谱鉴别结果

本研究在目前的中国药典标准薄层色谱鉴别上加入了大黄素甲醚对照品、大黄素对照品、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，通过此种方法来区分翼蓼药材、头花千金藤、索骨丹、白首乌与何首乌的区别，结果发现，何首乌的主要斑点色谱行为和毛脉蓼相似，有研究显示[8-9]，何首乌和毛脉蓼均含有大黄素甲醚和大黄素，而不同的是何首乌缺少毛脉蓼的虎杖苷，但何首乌有2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，这两个苷元都是茋类化合物[10]。通过仔细观察图谱可以发现，2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷与虎杖苷的区别在紫外光365 nm下检视颜色不同，另外虎杖苷斑点上面还有一个明显的主斑点，颜色为桔红色，所以这可以用来区分毛脉蓼和何首乌。见图2。

图2 其他混伪品种和何首乌薄层色谱图

3.2 高效液相色谱特征图谱鉴别结果

其他混伪品种和何首乌的高效液相特征图谱与薄层色谱基本相同，通过薄层色谱可以很好的区分翼蓼药材、头花千金藤、索骨丹、白首乌与何首乌的区别。见图3。

但何首乌和毛脉蓼的图谱较为相似，见图4，两者均有色谱峰2～5，化学成分分别为大黄素甲醚、大黄素、大黄素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷。何首乌中成分二苯乙烯苷（见图4峰1）与毛脉蓼药材中的虎杖苷（见图4峰6）化学结构很相似，且色谱峰的保留时间（9.8 min/10.1 min）也很接近，所以很容易将两者混淆。仔细分析图谱可以发现，色谱峰7可以区分毛脉蓼和何首乌，经过二极管阵列检测器检测发现，色谱峰7的最大紫外吸收波长和虎杖苷一致，因此可以初步判断色谱峰7可能具有二苯乙烯类结构母核的苷类化合物，但还需要进一步深入研究其化学信息。

图3 其他混伪品种与何首乌的高效液特征图谱

4 讨论

本研究所有建立的高效液相色谱特征图谱、薄层色谱以及性状鉴别法可有效却分何首乌与其他常见伪品药材的区别，且高效液相色谱特征图谱和薄层色谱还可以相互补充和验证。本研究有以下2个方面需要注意：（1）在目前的二苯乙烯苷含量测定项下，何首乌流动相条件为乙腈-水,2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色谱峰保留时间约7min，这个色谱峰保留时间与毛脉蓼的虎杖苷会重合，容易导致误判，作者认为应将二苯乙烯苷含量测定项下流动相调整，以便两者分离。（2）毛脉蓼药材特征图谱的峰7是区别何首乌的关键，应加大对其的化学结构研究，若不法分子用酸水解毛脉蓼来替代何首乌，可以用这种苷类化合物来判断。

图4 其他混伪品种与何首乌的高效液特征图谱

[1]高任龙，王会肖，李晓娜，等.何首乌的药理毒理研究进展[J].河北医药，2015，37（2）：269-271.

[2]张庆华，易炳学.何首乌炮制研究进展[J].中国中医药信息杂志，2014，21（3）：132-136.

[3]韩莹，毕福钧，侯惠婵，等.近红外光谱法鉴别何首乌真伪的应用研究[J].中国中药杂志，2014，39（22）：4394.

[4]嵇艳.对鹿茸、人参、何首乌、茯苓等几种中药饮片真伪鉴别方法的分析[J].医药卫生：全文版，2016，2：00240.

[5]张丹丹，徐新刚，闫雪生.3种中药成方制剂中何首乌、虎杖、决明子薄层鉴别方法的建立[J].中南药学，2015，13（12）：1310-1313.

[6]魁学刚，马孝龙，喇凤英.何首乌与白首乌的鉴别实验研究[J].甘肃医药，2016，35（3）：228-230.

[7]刘越，罗定强，王国海，等.何首乌药材及常见伪品的真伪鉴别方法研究[J].中药材，2017，40（6）：1305-1308.

[8]王志伟，闫慧娇，陈跃，等.氢核磁共振法测定何首乌中大黄素和大黄素甲醚的含量[J].药物分析杂志，2016，36（12）：2163-2167.

[9]刘兴朵.高压炮制对何首乌中大黄素、大黄素甲醚及二苯乙烯苷含量影响的分析[J].当代医药论丛，2014，12（8）：141.

[10]侯明月，李玮，王建科，等.不同产地加工方法对何首乌中二苯乙烯苷含量的影响[J].山地农业生物学报，2014，33（6）：90-92.