金纳米棒在肿瘤分子影像诊断和靶向治疗中的应用*

张影影， 覃春霞， 张永学

1华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，湖北省分子影像重点实验室， 教育部生物靶向治疗重点实验室，武汉 4300302河南省肿瘤医院郑州大学附属肿瘤医院核医学科，郑州 450008

金纳米棒在肿瘤分子影像诊断和靶向治疗中的应用*

张影影1，2， 覃春霞1△， 张永学1

1华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，湖北省分子影像重点实验室， 教育部生物靶向治疗重点实验室，武汉 4300302河南省肿瘤医院郑州大学附属肿瘤医院核医学科，郑州 450008

金纳米棒； 表面偶联； 肿瘤显像； 光热治疗

近年来，纳米材料及其表面修饰技术的发展，使以纳米特性为基础设计生物相容性的纳米探针并用于疾病的显像、局部治疗和药物运输成为可能。其中金纳米颗粒可以与DNA[1]、多肽[2]、抗体[3]、放射性核素[4]等相偶联，实现对肿瘤的靶向检测、显像及治疗。此外，纳米颗粒在肿瘤区域具有渗透滞留效应(enhanced permeability and retention，EPR)，可促进大分子物质的选择性分布，增加药效并减少系统副作用[5]。在近红外区域(near infrared，NIR)，生物组织中的血红蛋白和水对光的吸收最少[6]。金纳米棒(gold nanorods，GNRs)作为金纳米颗粒的典型代表，通过控制合成过程中的反应条件，可调控GNRs的长径比使其纵向等离子共振吸收峰位于此区域[7]，使其具备较高的光热转换效率[8]，可用于光学显像、光热治疗和光控药物释放等。而球形金纳米颗粒由于高度对称的结构，表现为单一的可见光区的等离子共振吸收峰，限制了其在生物体内的一些应用[9]。在此我们主要讨论GNRs在肿瘤的诊断和治疗方面的研究进展，包括GNRs的合成方法、表面偶联化合物、肿瘤的显像和治疗等。

1 GNRs的制备

GNRs的合成方法包括模板法[10]、电化学法[11]、光化学法[12]、晶种生长法[13]等。其中晶种生长法是制备GNRs最成功的方法，主要有3种合成方式：①种子介导的三步合成法。准备3份含有氯金酸盐(HAuCl4)、十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)和抗坏血酸的生长液A、B、C，将被覆柠檬酸盐的3.5 nm的金纳米颗粒加入到A生长液中，反应4～5 h后加入到B生长液中；再过4～5 h，从B生长液中取出一部分加入到C生长液中反应一定时间，然后离心纯化。这种方法是合成长径比大于8的GNRs的较好方法[14]。此方法合成的GNRs尺寸较大，有较强的光散射作用，在暗场显像方面占有一定的优势。②银介导的晶种合成法。利用被覆CTAB的1.5 nm的金纳米颗粒为晶种，生长液中较之前的合成方法新加入了硝酸银，通过调节生长液中Ag+浓度，可合成长径比为2～5的表面被覆Ag+的单晶体结构的GNRs[15]。③无种子合成法。成核和生长在同一个反应体系中完成，用少量的强还原剂氢硼化钠在原位产生晶种，抗坏血酸引发生长。通过控制合成过程中氢硼化钠、Ag+及CTAB的浓度、调节反应体系的pH值，可合成长径比为2～5的GNRs。这种小尺寸的GNRs吸光能力强、散射能力弱，在光热治疗方面具有独特的优势[16]。

2 GNRs的表面修饰

上述晶种生长法合成的GNRs表面均覆盖CTAB，CTAB作为合成过程中的支持电解质和稳定剂，具有生物毒性，会激活细胞内的活性氧系统，引发线粒体肿胀，最终导致细胞自噬和凋亡[17]。因此需对其进行表面修饰，常用的修饰方法有配体交换、高分子电解质吸附、无机物二氧化硅(SiO2)修饰等。2006年Niidome等[18]首次报道了用聚乙二醇(PEG)取代GNRs表面的CTAB，经PEG取代后的金纳米棒(PEG-GNRs)Zata电位变为中性，可降低巨噬细胞和血浆蛋白的非特异性结合。并经体内研究发现，尾静脉注射后30 min约30%的CTAB-GNRs聚集在肝脏，而PEG-GNRs主要分布于血液中，72 h后除肝脏外其他器官几乎没有PEG-GNRs的聚集，说明PEG修饰的GNRs具有良好的生物相容性及较长的血液循环时间。该修饰方法反应条件温和，修饰后GNRs的稳定性好，是目前最常见的GNRs的修饰方法。此外，聚苯乙烯磺酸钠(polystyrene sulfonate，PSS)、聚烯丙基胺盐酸盐(poly allylamine hydrochloride，PAH)及无机SiO2等也可以用于修饰金纳米棒改善其生物相容性。Wan等[19]研究发现经高分子电解质PSS、PAH等修饰的GNRs生物毒性明显降低，并通过体内实验证实PAH-GNRs具有良好的生物相容性及较长的血液半衰期，该修饰方法主要通过静电作用使其沉积在金纳米棒表面，虽然过程快捷、简单，但其稳定性和修饰后金纳米复合物的均一性有待提高。与上述2种修饰方法相比，无机SiO2修饰的GNRs有较高的细胞摄取率和光热消融效应。但该过程需要高温煅烧，而GNRs不耐高温，因此限制其进一步的修饰及应用[20]。

3 以GNRs为平台相关物质的偶联

GNRs特殊的晶体结构赋予其较高的反应活性[21]，可以作为很好的载体制备GNRs靶向复合物材料、生物医用造影剂和纳米探针等，并可以通过透射性电子显微镜、Zeta电位、红外光谱、紫外-可见光谱、动态光散射等进行修饰成功后的检测。主要的偶联物质有以下几类。

3.1 靶向分子

将靶向肽、叶酸、抗体等物质与GNRs相连后可同时具备主动和被动双重靶向效应，增强金纳米复合物在肿瘤部位的富集[22]。例如靶向配体RGD可与高表达αVβ3的肿瘤特异性结合[23]；将叶酸连接到GNRs表面可使该探针靶向达到高表达叶酸受体的肿瘤部位[24]；上述均通过受体-配体结合实现主动靶向作用，同时探针的纳米特性可在实体瘤部位通过EPR效应实现被动聚集。Joshi等[25]利用抗原抗体结合原理将内皮生长因子受体(EGFR)的特异性抗体225和非特异性抗体RG-16分别定向连接在GNRs表面，使上述纳米探针具备良好的靶向性，且抗体的定向连接使其发挥较高的效价，同时由于巨噬细胞不能与抗体的Fc段结合，可降低机体免疫系统的反应，延长体内循环时间。

3.2 放射性核素

连接有放射性核素的金纳米探针可用于PET/SPECT显像，具有较高的灵敏度。放射性核素与金纳米的偶联包括直接法和间接法。①卤族元素可化学吸附在金的表面，其中碘离子和金原子之间的亲和力最强，可直接结合在GNRs的表面[26]，该反应过程简单、快速、条件温和。Shao等[27]用125I标记GNRs，标记过程简单、快速，具有较高的放化产率，且不会破坏GNRs的光学性质，并通过γ显像监测125I标记的GNRs在动物体内的生物学行为，再次证实PEG修饰的GNRs具有良好的稳定性和较长的血液循环时间。②放射性核素64Cu、99mTc等不能直接与金反应，需要通过螯合剂间接标记到GNRs表面。Xiao等[28]将放射性核素64Cu通过螯合剂NOTA与GNR-DOX-cRGD相偶联，可同时用于肿瘤的靶向药物释放和PET显像，并通过感兴趣区半定量分析放射性探针在动物体内的分布与生物分布结果相一致。Morales-Avila等[29]通过螯合剂HYNIC将核素99mTc连接于金纳米颗粒表面制备出放射性核素探针用于肿瘤的SPECT/CT显像并取得良好的显像结果。

3.3 荧光物质

荧光成像灵敏度高、重复性好、标记靶点多样，有利于人们从细胞、分子水平研究相关生物学过程，但易受细胞、组织背景的干扰。Gao等[23]合成集荧光显像和靶向治疗于一体的多功能探针RGD/FITC-DEVD-Au-Fe2O3，γ-Fe2O3可介导自由基羟基(·OH)的产生，从而导致细胞的氧化损伤和凋亡；异硫氰酸荧光素(FITC)与Capsase-3的识别序列(DEVA)相连接，FITC的荧光共振能量可传递到Au而发生荧光淬灭，在凋亡过程中DEVA被Caspase-3识别并剪切，从而使淬灭的荧光恢复，因此上述探针可用来检测癌细胞的凋亡过程。

3.4 治疗药物

以GNRs为载体可将化疗药物靶向输送到肿瘤部位，增加药物疗效，减少系统副作用。Xiao等[30]通过DNA的自组装作用将化疗药物阿霉素(DOX)靶向输送到肿瘤部位。在NIR激光照射下，GNRs将光能转化为热能，促使DNA双链解螺旋引起化疗药物的释放，可用于光热治疗和化疗。

4 在显像及治疗领域的应用

4.1 显像领域

既可利用GNRs优良的光学性质进行光声显像、暗场显微镜成像、双光子荧光显像和光学相干层析显像，又可以利用GNRs与放射性核素的偶联用于放射性核素显像。

4.1.1 光学显像 ①光声显像(PAT)：GNRs在NIR区较大的吸收截面和较高的光热转化能力，使周围组织热膨胀产生超声波，比单纯的超声显像具有更高的分辨率和成像深度。随着纳米探针浓度的增加，光声信号的强度也随之增加。此外，研究发现GNRs可以增强多壁碳纳米管的光声信号强度[31]。连接叶酸(FA)的金纳米探针特异性地与高表达叶酸受体的癌细胞结合，向HeLa荷瘤鼠静脉注射FA-GNRs后，PAT显像示6 h后肿瘤部位由于FA-GNRs的聚集显示较高的亮度，24 h后肿瘤部位可探测到明显的光声信号且肿瘤轮廓显示清晰[32]。②暗场显像：粒径较大的GNRs对光有较强的散射作用，可作为暗场成像的造影剂，用于功能化金纳米棒在体外细胞实验中的靶向定位研究。Wang等[31]将RGD连接到杂交金纳米sGNR/MWNT(multiwalled carbon nanotubes)表面制备出RGD-GNR-MWNT纳米探针，细胞实验发现由于纳米探针可以与高表达RGD受体的MGC803细胞系特异性结合，通过暗场显微镜观察到呈现明亮的金色。③双光子荧光显像：GNRs的纵向等离子共振特性可应用于双光子荧光成像，具有背景荧光低、信噪比高的优点，可实时监测肿瘤细胞坏死情况，且发现当红外激光功率增加到一定程度时双光子荧光信号明显减弱，说明大部分GNRs此条件下已经发生热溶化，在NIR区域不再产生等离子共振现象[33]。此外，双光子荧光成像还可以监测功能化的GNRs摄取、药物释放及胞内定位等[34]。④光热-光学相干成像(photothermal-optical coherence tomography，PT-OCT)：GNRs在生物组织的特定部位聚集时，可显著增强信号的对比度用于PT-OCT成像。Tuckerschwartz等[35]以GNRs为显像剂用于动物体内的PT-OCT成像，由于GNRs表面较强的光吸收和散射作用，可显著增加光学信号的强度。与传统的OCT相比，具备高空间分辨率及较佳的成像深度。

4.1.2 放射性核素显像 GNRs与放射性核素偶联后可用于SPECT和PET显像。如用125I标记GNRs，可利用125I发出的γ射线行SPECT显像[27]。将64Cu连接到GNRs表面可得到稳定的核素示踪剂，通过PET显像可以精确监测和定量分析纳米复合物在生物体内的分布情况并进一步指导进行有效的光热治疗[36]。

上述以GNRs为基础进行的分子显像的研究为实现放射性核素的SPECT、PET显像和GNRs光学性质显像的结合提供了一个新的思路。

4.2 治疗领域

GNRs在NIR区域具备较高的光热转换效率，可用于光热、光声治疗及热控药物释放等。

4.2.1 光热治疗 热诱导细胞产生一系列的损伤，如细胞膜出泡、细胞膜蛋白和线粒体的热失活、热休克蛋白的产生等。Tong等[33]研究了光热效应导致细胞损伤的机制，FA-GNRs探针与过表达叶酸受体的恶性KB细胞特异性结合，在NIR激光照射下，GNRs产生的光热作用引起胞内肌动蛋白的降解，大量Ca+内流导致胞膜出泡，肿瘤细胞坏死。Heidari等[2]将蛙皮素(Bombesin，BBN)类似物偶联于GNRs表面，制备出GNR-BBN-PEG探针，在NIR激光的照射下，由于GNRs的光热效应，体外细胞实验显示T47D细胞发生明显的损伤，而对照组却无明显变化。体内实验显示实验组荷瘤鼠肿瘤完全消失，而对照组肿瘤持续生长。

4.2.2 光声治疗 在NIR区GNRs较强的光热转换作用可使肿瘤部位热膨胀产生强的休克波，导致大多数癌细胞20 s内死亡，从而有效地抑制肿瘤生长[32]。

4.2.3 热控药物释放 GNRs为载体，将药物分子通过物理吸附和化学键两种方式连接在GNRs表面，利用GNRs光热转换产生的热量，可控制药物的释放。例如Zhong等[37]合成cRGD-HN-DOX纳米探针，用于荷人胶质瘤(U87MG)鼠的靶向化疗。研究显示，生理条件下cRGD-HN-DOX几乎不释放DOX，而在NIR照射下，由于GNRs的光热转换作用可引起DOX的大量释放。与单纯DOX相比，cRGD-HN-DOX具有较长的体内循环时间，且化疗副作用小，可有效抑制肿瘤的生长，延长荷瘤鼠的生存时间。

5 小结及展望

由于GNRs具有独特可调的光学性质使其在生物医学领域有着广泛而重要的应用前景，可作为生物分子和某些药物的载体，又可作为生物显像、治疗的活性试剂，还可作为检测生物分子的超敏生物传感器。目前，由于诊疗一体化、多模态显像及治疗药物的研究，GNRs独特的光学性质成为关注的焦点。通过对GNRs的表面修饰及功能化，可同时集多模态靶向诊断、治疗及疗效监测于一体，成为未来生物医学研究的一个方向。但由于目前GNRs的合成原理还有待于进一步研究，仍存在产率和纯度不高的问题，无法大规模生产。GNRs的生物无毒化修饰及共轭靶向分子的连接存在一些困难，且其生物毒性、稳定性、体内分布代谢等问题还有待于进一步深入研究。

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(2016-08-16 收稿)

*国家自然科学基金资助项目(No.81401444)；华中科技大学自主创新研究基金资助项目(No.2014QN038)

R454.2,R445

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.024

张影影，女，1990年生，硕士研究生，E-mail：zhangy15090@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：t0317008@163.com