对壳聚糖纳米粒在气道粘膜粘附性的实验研究

汪程　汪令伟　王林

摘要：目的 通过在体和离体实验研究壳聚糖纳米粒在气道粘膜的粘附性。方法 通过雾化吸入和灌洗的方式将荧光标记的壳聚糖纳米粒作用于气管、支气管和肺组织上。在激光共聚焦显微镜下观察壳聚糖纳米粒的粘附情况并考察其在气道粘膜上的滞留时间。结果 壳聚糖纳米粒组和载胰岛素壳聚糖组在气管、支气管及肺组织上的荧光强度比较无明显差异，P>0.05；胰岛素组与其他两组的荧光强度相比有明显差异，P<0.05。壳聚糖纳米粒在雾化后30 min、2 h、5 h、8 h通过激光共聚焦显微镜可见气管、支气管、肺组织均有荧光显示。结论 壳聚糖纳米粒与气道粘膜具有粘附性；其在气道粘膜上的滞留时间可以达到8 h以上。

关键词：壳聚糖；纳米粒；气道粘膜；粘附性

肺部吸入给药是将药物直接传递到肺部、产生局部或全身治疗作用的给药方法。具有将药物直接在肺部起效、并能使肺部疾病的药物剂量降低及减小药物的副作用的优点[1]。但是肺部是机体呼吸场所，外界的异物主要依靠粘液纤毛机制来清除，尤其是不溶性微粒[2]，这是影响肺部给药的关键因素。殼聚糖纳米粒将生物粘附性和药物缓释特性集于一体，使其在定位、缓释、提高生物利用度等方面具有显著优势[3]。壳聚糖纳米粒作为药物载体在口腔、胃肠道等部位的应用已经得到了广泛的研究，然而在与呼吸道粘膜粘附性的研究方面，国内外的报道较少。本研究以新西兰大白兔为实验对象，利用壳聚糖纳米粒生物学特性，研究壳聚糖纳米粒与呼吸道粘膜的粘附性，观察比较壳聚糖纳米粒在气管、支气管及肺组织的粘附性情况，为壳聚糖纳米粒作为药物载体肺部给药及作用于肺内局部疾病的治疗提供理论依据，具有重要的临床应用价值。

1资料与方法

1.1实验动物 同系交配纯种白色新西兰大白兔 大连大学实验动物中心提供。

1.2实验材料及仪器 壳聚糖（CS）购自阿拉丁；异硫氰酸荧光素（FITC）、N-羟基琥珀酰亚胺、2，3-环氧-1-丙醇购于Sigma公司；磁力搅拌油浴（上海越众仪器）；高速离心机（日立）；冷冻干燥机（北京博医康）；超声波雾化器（鞍山电子医疗器械厂）；激光共聚焦显微镜（德国）。

1.3方法

1.3.1壳聚糖纳米粒的制备及荧光标记

1.3.1.1壳聚糖的疏水改性 取纯化后的壳聚糖，分散于200ml超纯水，滴加冰乙酸使壳聚糖完全溶解，置入60℃水浴预热。取DCA、EDC·HCl和NHS于150 ml烧杯、加入100 ml无水DMSO，反应30 min，加到60℃并反应24 h。取出反应完毕的壳聚糖溶液，加入一定量的无水甲醇，用浓氨水调pH至中性，迅速将悬液于8000 rpm离心10 min收集沉淀，最后于烘箱中烘干，最终得到淡黄色粉末状疏水壳聚糖。

1.3.1.2疏水壳聚糖的亲水改性 将疏水改性后的壳聚糖样品，分散于超纯水，滴加冰乙酸使壳聚糖溶解，60℃水浴预热，逐滴加入环氧丙醇，搅拌反应24 h。用4M NaOH溶液调pH至8左右，于8000 rpm下离心10 min，然后将上清液置入8 K～14 K透析袋中对大量去离子水透析48 h。最后将样品冷冻干燥，最终得到白色棉絮状的两亲性壳聚糖。

1.3.1.3两亲性壳聚糖的荧光标记 取两亲性壳聚糖超纯水，加入NaHCO3和Na2CO3粉末得0.25M碳酸盐缓冲体系，最终pH=9.5。精确称取5 mg FITC溶于5 ml甲醇后在搅拌下逐滴缓慢加入两亲壳聚糖溶液中，避光反应12 h。收集反应液置入8 K～14 K透析袋对大量去离子水透析48 h，最终冷冻干燥得到橙黄色FITC标记的两亲性壳聚糖。

1.3.1.4荧光纳米粒悬液的制备 取一定质量的FITC标记两亲性壳聚糖，溶解于超纯水，在冰浴中用探头是超声分散20次，工作6s/次，间隔4s，超声功率80 W。最后用0.8 μm水系滤膜过滤，-20℃下避光保存。

1.3.1.5荧光标记胰岛素的制备 称取猪胰岛素200 mg分散于45 ml超纯水，加入NaHCO3和Na2CO3粉末得0.25 M碳酸盐缓冲体系，最终pH=9.5。精确称取5.0 mg FITC溶解于5 ml甲醇后在搅拌下逐滴缓慢加入胰岛素溶液中，搅拌混合均匀后，置于4℃下避光反应12 h。反应结束后，称取2 mg甘氨酸用少量去离子水溶解后滴入反应液以终止反应。以体积排阻色谱法除去未反应的FITC、缓冲盐、甘氨酸和少量杂质与副产物（葡聚糖凝胶柱Ф15 mm*200 mm，固定相为sephadex G25），收集最先流出的黄色条带组分，合并后冷冻干燥，得到纯净的橙色FITC标记胰岛素粉末。

1.3.1.6荧光标记胰岛素的装载 装载方法与同1.3.1.4类似，只是在开始时加入INS与两亲壳聚糖纳米粒混合。

1.3.2在体和离体实验对壳聚糖纳米粒粘膜粘附性考察

1.3.2.1 实验动物分组 实验动物随机分成6组。在体实验3组：壳聚糖纳米粒组、载胰岛素壳聚糖组、胰岛素组；离体实验3组：壳聚糖纳米粒组、载胰岛素壳聚糖组、胰岛素组。

1.3.2.2 大白兔的雾化 利用超声波雾化法给予大白兔雾化吸入实验液体，时间为15 min，待雾化结束后处死家兔，解剖取气管、支气管、肺组织，标本盒用铝箔纸包裹避光保存于冰盒中等待冰冻切片。

1.3.2.3大白兔的肺部灌洗 将大白兔处死解剖分离出完整的气管及肺叶，用1 ml注射器通过气管，注入实验液约400 ul，5 min后使灌洗液自然流出后用1 ml注射器通过气管注入1ml 0.9%氯化钠注射液进行灌洗。用组织剪分离出气管、支气管、肺组织，标本盒用铝箔纸包裹避光保存于冰盒中等待冰冻切片。

1.3.3壳聚糖纳米粒在呼吸道粘膜的滞留时间考察

1.3.3.1实验动物的超声雾化吸入 实验动物随机均分为4组，每组6只。雾化方法同上。将四组大白兔分别于雾化结束后30 min、2 h、5 h、8 h后解剖并分离出气管、支气管、肺组织（方法同上）。

1.3.3.2冰冻切片的制作及荧光显微镜观察拍照 从标本盒中取出各组织块将其平放于特制小盒内，加适量OCT包埋剂完全淹没组织，将气泡用吸头洗出；然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，使小盒底部接触液氮，约20 s组织即迅速冰冻成块。在样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上（放置组织时注意把气管、支气管的纵轴向上），再添一层OCT胶，使其完全覆盖组织，然后置于切片机中的冷冻台上，在-20℃条件下放置2 min后进行切片，切片的厚度为10 μm，将切好的切片置于载玻片上，放在冰盒内保存，冰冻切片制作过程中尽量避免光线直接照射。切片完毕后送至暗室内使用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

1.4 统计学处理 采用SPSS（17.0版）计算机数据分析处理软件，数据以均数±标准差表示，组组均数之间两两对比采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1壳聚糖纳米粒的制备及荧光标记 通过对壳聚糖的亲水、疏水改性及FITC反应得到如下特征的荧光标记的壳聚糖纳米粒：其基本理化性质：粒径：253 nm±9 nm，表面电位：12.3mV±1.2 mV。

2.2在体雾化后各组之间气管粘膜上的荧光强度分析比较 在体实验雾化后，在激光共聚焦显微镜下可见三组实验动物气道粘膜上皆有绿色荧光显示。三组动物通过不同的雾化液雾化后，对三组动物的气管粘膜、支气管粘膜及肺组织上的荧光强度互相进行分析比较：壳聚糖纳米粒组与壳聚糖载胰岛素组，P>0.05；壳聚糖纳米粒组与胰岛素组，P<0.05；壳聚糖载胰岛素组与胰岛素组，P<0.05，见表1，图1。

2.3离体灌洗后各组之间气管粘膜上的荧光强度分析比较 离体灌洗后，在激光共聚焦显微镜下可见三组实验动物气道粘膜上皆有绿色荧光显示。三组动物的离体支气管肺组织通过不同的灌洗液灌洗后，对三组动物的气管粘膜、支气管粘膜及肺组织上的荧光强度互相进行分析比较：壳聚糖纳米粒组与壳聚糖载胰岛素组，P>0.05；壳聚糖纳米粒组与胰岛素组，P<0.05；壳聚糖载胰岛素组与胰岛素组，P<0.05，见表2。

2.4壳聚糖纳米粒在呼吸道粘膜的滞留时间考察 激光共聚焦显微镜下气管粘膜、支气管粘膜及肺组织内的绿色荧光显示反映了壳聚糖纳米粒雾化吸入后在气道上有大量粘附。通过荧光强度分析，随着时间的延长壳聚糖纳米粒在气道粘膜上的荧光强度逐渐减弱，但在雾化吸入后8 h的气管粘膜、支气管粘膜及肺组织上的荧光强度仍强于在体实验雾化后胰岛素组的荧光强度，见表3，图2。

3讨论

壳聚糖是一种天然高分子材料，又名脱乙酰甲壳素，化学名为β-（1-4）-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是甲壳素用浓碱处理后脱去乙酰基得到的产物[4]，具有良好的生物相容性、无毒性、生物粘附性及生物可降解性[5]。以壳聚糖为代表的载体材料近些年被医药界制备成载药纳米粒广泛应用于生物医药和制剂。壳聚糖纳米粒制备工艺成熟，主要有复凝聚法、共价交联法、离子凝胶化法、乳化/溶剂扩散法、沉淀法、化学结构修饰等[6]。壳聚糖纳米粒作为药物载体目前在国内外已做了不少的研究，并取得了一定成就。有研究将壳聚糖通过雾化吸入的方式给予维斯塔大鼠后，通过检测肺组织的蛋白、羟基基团、氧化性谷胱甘肽等发现给予70 mg/kg剂量的壳聚糖不会引起肺组织的氧化应激及炎症反应。Liqin Jiang等研究发现经硫醇化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS口服抗肿瘤药物载体能够增加紫杉醇在胃粘膜的滞留时间并能增加药物在粘膜的渗透作用。Janes等通过壳聚糖纳米粒载阿霉素，体外实验检测发现阿霉素的释放达到了良好的缓释效果，能够平稳释放5 d；再通过C26细胞郁积实验表明，在0.1～100 μg·ml-1阿霉素内，壳聚糖交联阿霉素在抑制细胞活性的水平上相比阿霉素溶液没有明显差别，这说明壳聚糖纳米粒载阿霉素不会明显的降低药效。Sanjay Patildeng 等将壳聚糖作为卡维地洛的载体，通过鼻粘膜给药途径给予家兔药物，发现其与鼻粘膜具有较好的粘附性，且在8 h内其释放率为75%，吸收率和生物利用度达到72.29%。

壳聚糖纳米粒除了载药作用于局部粘膜缓慢释药的特性外，其无毒性、生物相容性及生物降解性是其作为药物载体必不可少的条件。张小茜等用蛙的上颚进行呼吸道粘膜的毒性研究，通过体内及体外实验表明壳聚糖载载药微球纤毛持续运动时间、纤毛运动频率与生理盐水组相比无明显的差异，并且通过对比壳聚糖载药组和正常组LDH（细胞内的标志酶，细胞膜受损伤后从细胞内渗透出来，是肺急性细胞毒性的敏感指标）的活性发现，两组之间的LDH活性无明显差异，均说明了壳聚糖作为给药载体用于肺部给药是安全的。Zhang Y等制备出海藻酸钠壳聚糖微球作为胰岛素给药载体，以糖尿病大鼠为研究对象，口服给药作用于胃肠道粘膜，研究表明微球载体不仅能保护胰岛素被胃蛋白酶和酸性胃液破坏，而且能够缓慢释药，延长药物的作用时间，使血糖水平有效地降低并稳定的保持较长的时间。

本研究通过在体实验和离体实验两种实验方法，以肺部给药模型药物胰岛素为对照，证明了壳聚糖纳米粒在气管粘膜上具有粘附性并能提高药物在气管粘膜上的粘附率；壳聚糖纳米粒的粘附时间考察显示壳聚糖纳米粒在气管粘膜上的粘附率随着时间的延长而减小，在给药后8 h仍有部分壳聚糖纳米粒粘附在气管粘膜上。

参考文獻：

[1]王燕英，蔡映云.气雾剂在呼吸系统疾病中的合理应用.药学服务与研究，2008，8（2）：149-151.

[2]Paul Zarogoulidis， Ekaterini Chatzaki，et al. Inhaled chemotherapy in lung cancer：future concept of nanomedicine[J].Int J Nanomedicine，2012， 7：1551-1572.

[3] Inderjit Jabbal-Gill， Peter Watts，et al. Chitos an-based delivery systems for mucosal vaccines[J].Expert Opin Drug Deliv，2012，9（9）：1051-1067.

[4]Gang-Biao Jiang，Daping Quan，et al.Preparation of polymeric micelles based on chitosan bearing a small amount of highly hydrophobic groups[J].Carbohydrate Polymers，2006，66：514-520.

[5]Inmaculada Aranaz，Ruth Harris，Angeles Heras.Chitosan Amphiphilic Derivatives[J].Chemistry and Applications.Current Organic Chemistry，2010，14：308-330.

[6]郝英魁，杨学东.载药壳聚糖纳米粒的研究进展[J].中国药学杂志，2005，40（17）：1292-1295.

编辑/申磊