2014、2015年度武汉地区急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物RSV和hMPV基因检测分析

王晓玲，王强，夏洁

(湖北省武汉市普仁医院，武汉430081)

2014、2015年度武汉地区急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物RSV和hMPV基因检测分析

王晓玲，王强，夏洁

(湖北省武汉市普仁医院，武汉430081)

目的 观察2014年度和2015年度武汉地区急性呼吸道感染(ARTIs)患儿鼻咽分泌物中呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)基因检出情况，并分析RSV、hMPV感染的分布特点。方法 2014年1月～2015年12月收治的0～14岁的ARTIs患儿816例(2014年度456例、2015年度360例)，采集患儿鼻咽分泌物，采用RT-PCR检测RSV G基因、hMPV F基因，通过DNA测序分析基因型。观察RSV、hMPV感染在不同年度、季节及不同性别、年龄、病种患儿中的分布情况。结果 816例患儿中，检出RSV 187例，其中2014年度109例、2015年度78例；检出hMPV 116例，其中2014年度69例、2015年度47例；2014年度和2015年度hMPV、RSV的检出率差异均无统计学意义。1～2岁年龄组患儿hMPV检出率最高，5岁以内患儿hMPV检出率高于90%；5岁以内患儿RSV检出率也较高，高于90%。喘息性支气管炎、毛细支气管炎患儿hMPV检出率显著高于其他感染部位(P均<0.05)，上呼吸道感染、支气管炎、支气管肺炎患儿hMPV检出率较低(10%左右)；支气管肺炎、毛细支气管炎患儿RSV检出率高于其他感染部位(P均<0.05)，喘息性支气管炎患儿RSV检出率最低。每年2～3月hMPV、RSV检出率最高，6～9月最低。基因型分析显示，2014、2015年度患儿检出RSV基因型均以A型为主，2014年度患儿检出hMPV基因型以A2型为主、2015年度以B型为主。结论 RSV和hMPV是武汉地区ARTIs患儿常见的病原体，RSV、hMPV感染多发生在5岁以下患儿，且多发于冬季和早春；RSV感染与支气管肺炎、毛细支气管炎有关，hMPV感染与喘息性支气管炎、毛细支气管炎有关；RSV流行毒株以A型为主，hMPV流行毒株在2014、2015年度存在差异。

呼吸道感染；呼吸道合胞病毒；人偏肺病毒；儿童；武汉市

急性呼吸道感染(ARTIs)是儿童住院和死亡的主要原因之一，其中5岁以下患儿病死率较高[1]。病毒和细菌感染均能引起ARTIs，以病毒感染最为常见，主要包括呼吸道合胞病毒(RSV)感染和人偏肺病毒(hMPV)感染[2～4]。研究[4,5]表明，RSV和hMPV感染的分布与季节、地域和人群密切相关，不仅在不同地区或同一地区的不同年份、季节分布有所差异，毒株基因型和所引起疾病的临床症状也可能存在差异。为此，我们观察了武汉市2014、2015年度ARTIs患儿鼻咽分泌物中RSV、hMPV基因检出情况，并分析RSV、hMPV感染的分布特点，以期为疾病的防控提供一定参考。

1.1 临床资料 以武汉市普仁医院儿科2014年1月～2015年12月收治的0～14岁的ARTIs患儿为研究对象，排除持续性哮喘>7 d者。患儿中，<1岁132例(2014年度78例、2015年度54例)、1～2岁255例(2014年度141例、2015年度114例)、3～5岁343例(2014年度185例、2015年度158例)、6～14岁86例(2014年度52例、2015年度34例)，上呼吸道感染97例(2014年度63例、2015年度34例)、支气管炎240例(2014年度134例、2015年度106例)、喘息性支气管炎32例(2014年度21例、2015年度11例)、支气管肺炎411例(2014年度215例、2015年度196例)、毛细支气管炎36例(2014年度23例、2015年度13例)。2014、2015年度纳入患儿性别、感染部位和年龄差异无统计学意义。患儿于入院2 h内采用负压吸引器收集鼻咽分泌物，置于2 mL病毒运输液中，4～10 ℃保存，24 h内送至实验室以备后续检测。

1.2 RSV、hMPV基因检测 提取鼻咽分泌物中的病毒RNA，进行逆转录反应得到cDNA，进行PCR反应。目的基因引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。hMPV F基因上游引物序列为5′-CTTTGGACTTAATGACAGATG-3′，下游引物序列为5′-GTCTTCCTGTGCTAACTTTG-3′，产物长度450 bp[6]；RSV G基因C端上游引物序列为5′-ATGATTWYCAYTTTGAAGTGTTC-3′，下游引物序列为5′-GTTATGACACTGGTATACCAACC-3′，RSV A型产物长度665 bp，RSV B型产物长度为740 bp[7]。以GAPDH为内参。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s维持40个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察。

1.3 RSV、hMPV DNA测序及基因型分析 回收PCR产物，送至上海英俊生物技术有限公司进行DNA测序。RSV G基因C端PCR产物经DNA测序后与PubMed中的Blast DNA序列进行比对确认，再根据PCR产物长度确认RSV A型(665 bp)或B型(740 bp)。hMPV F基因的DNA测序结果采用Clustal W2软件进行序列比对，以GenBank中已有的A1、A2、B1、B2基因型参考序列为参照，分析hMPV的基因型。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析。计数资料以率表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法；计量资料以中位数表示，采用Wilcoxon秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hMPV、RSV基因检出情况 816例患儿中共检出hMPV 116例(14.22%)、RSV 187例(22.92%)，其中2014年度检出hMPV 69例(15.13%)、RSV 109例(23.90%)，2015年度检出hMPV 47例(13.06%)、RSV 78例(21.67%)。2014年度和2015年度hMPV、RSV的检出率差异均无统计学意义(P均<0.05)。

2.2 2014年度及2015年度不同性别、年龄、感染部位患儿hMPV和RSV基因检出情况 不同性别患儿hMPV、RSV检出率差异无统计学意义(P>0.05)。2014年度及2015年度不同年龄、感染部位患儿hMPV和RSV基因检出率差异无统计学意义(P均>0.05)；1～2岁年龄组患儿hMPV检出率最高，5岁以内患儿hMPV检出率高于90%；5岁以内患儿RSV检出率高于90%。喘息性支气管炎、毛细支气管炎患儿hMPV检出率显著高于其他感染部位(P均<0.05)，上呼吸道感染、支气管炎、支气管肺炎患儿hMPV检出率较低(10%左右)；支气管肺炎、毛细支气管炎患儿RSV检出率高于其他感染部位(P均<0.05)，上呼吸道感染、支气管炎患儿RSV检出率也较高，喘息性支气管炎患儿RSV检出率最低。详见表1。

表1 2014年度及2015年度不同性别、年龄、感染部位患儿hMPV和RSV基因检出情况

2.3 hMPV、RSV感染的季节分布 每年2～3月hMPV、RSV检出率最高，6～9月最低。ARTIs患儿hMPV、RSV感染主要集中在冬春季发生(见图1)。

2.4 患儿hMPV、RSV基因型分布 本次受检标本中hMPV A1、A2、B1、B2四种基因型的毒株均被检出，分别为4、66、26、21例；除罕见基因型A1型外，其他三种基因型的流行存在年度差异，2014年主要以A2型为主(88.4%，61/69)，2015年以B1(47.8%，22/46)和B2(39.1%，18/46)型为主。在RSV阳性标本中，RSV A型130例，其中2014年度83例、2015年度47例；RSV B型56例，其中2014年度26例、2015年度30例；2014、2015年度RSV基因型均以A型为主，但2015年度RSV B型所占比例高于2014年度(P<0.05)。

图1 不同月份hMPV、RSV检出情况

3 讨论

病毒感染是儿童ARTIs的重要原因之一，RSV是最常见的呼吸道病毒，hMPV感染也被证实具有普遍性[8]。为了解武汉地区ARTIs患儿RSV、hMPV感染情况，我们对我院2014、2015年度收治的816例ARTIs患儿鼻咽分泌物标本进行了RSV、hMPV基因检测，并将PCR扩增出的特异性核酸片段进行DNA测序和基因型分析。

所收集的816例标本中共检出hMPV阳性116例(14.22%)、RSV阳性187例(22.92%)，2014、2015年度hMPV和RSV的检出率差异均无统计学意义。不同性别患儿RSV、hMPV检出情况无统计学差异，但在不同年龄组中有明显差异。我们发现，90%的RSV、hMPV阳性标本来自5岁以下患儿，hMPV阳性标本最多来自1～2岁患儿，这与相关报道基本一致[3,4]。

我们观察了不同感染部位患儿鼻咽分泌物标本中RSV、hMPV检出情况，发现上呼吸道感染、支气管炎、支气管肺炎患儿hMPV检出率较低，均在10%左右；而喘息性支气管炎、毛细支气管炎患儿hMPV检出率显著高于其他感染部位；支气管肺炎、毛细支气管炎患儿RSV检出率高于其他感染部位，RSV在上呼吸道感染和支气管炎患儿标本中也有较高的检出率，但在喘息性支气管患儿标本中检出率最低。这提示RSV、hMPV感染均与毛细支气管炎高度相关，hMPV感染还与喘息性支气管炎有关，而RSV感染与支气管肺炎的发病也有一定相关性。

在温带地区，冬季和早春是RSV、hMPV感染的高发时段。本研究结果显示，武汉地区ARTIs患儿标本中RSV、hMPV的最高检出率也出现在冬季和早春，检出率最高峰出现在每年2～3月，6～9月检出率最低。这提示武汉地区RSV和hMPV的流行特点为全年散发，冬春季高发，两者流行高峰同步出现。

RSV基因型分布存在地域差异，总体以A型为主，不同年份中A、B亚型可共同流行或以一种亚型为主。本研究2014年度收集的标本中检出RSV A型83例(76.1%)、RSV B型为26例(23.9%)，2015年度检出RSV A型47例(60.3%)、RSV B型30例(39.7%)，两年度均以RSV A型流行为主。hMPV是单负链RNA病毒，根据F基因的核酸序列变异情况可将hMPV分为A、B两大基因型。在不同年份，hMPV流行的基因型会发生明显变化[9]。本研究结果显示，武汉地区ARTIs患儿标本中同时检出了hMPV A1、A2、B1、B2四种基因型，其中2014年度主要以A2亚型为主(88.4%)，2015年度以B1(47.8%)、B2(39.1%)亚型为主；A1亚型为罕见基因型，在两年度中检出率均小于5%，这与相关报道基本一致[9～11]。

本研究表明，RSV和hMPV是武汉地区ARTIs患儿常见的病原体，RSV感染主要集中在<5岁患儿，hMPV感染主要集中在<2岁患儿；RSV感染与支气管肺炎、毛细支气管炎有显著相关性，hMPV感染与喘息性支气管炎、毛细支气管炎的发病有关；冬季和早春是RSV、hMPV感染高发时段；RSV以A型毒株流行为主，而hMPV流行基因型在不同年份有明显改变。

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王晓玲(E-mail: wxl76329@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.027

R511；R725.6

B

1002-266X(2017)03-0084-03

2016-09-26)