白蜡及白蜡高级烷醇对人真皮乳头细胞生长的影响

王占娣，冯 颖，李 娴，丁伟峰，马李一，陈晓鸣

(中国林业科学院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明 650224)

白蜡及白蜡高级烷醇对人真皮乳头细胞生长的影响

王占娣，冯 颖，李 娴，丁伟峰，马李一，陈晓鸣*

(中国林业科学院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南 昆明 650224)

白蜡；白蜡高级烷醇；吐温80；人真皮乳头细胞

白蜡虫(Ericeruspela(Chavannes))是一种重要的林业资源昆虫，其主要寄主植物为白蜡树(FraxinuschinensisRoxb.)和女贞(LigustrumlucidumAit.)。白蜡虫雄性二龄幼虫在寄主植物上分泌的次生代谢物质为白蜡。白蜡是我国的一种重要林副产品，采用氢化铝锂还原法或皂化法提炼后能够得到高级烷醇[1-2]。高级烷醇能降低胆固醇，促进细胞成熟[3-4]；但是白蜡和高级烷醇均不溶于水，限制了人们对白蜡及高级烷醇的开发和利用。笔者通过研究发现：白蜡和白蜡高级烷醇能溶解到含有吐温80的水溶液中，但吐温80易诱导细胞的脱粒作用[5]。因此，用吐温作为白蜡及高级烷醇的增溶剂进行生物活性筛选时需要考虑其对细胞的安全性。

人真皮乳头细胞是毛囊生长调节的重要细胞，它存在于毛囊的基底部位，调控毛囊的生长、循环，指导毛基质细胞分化形成毛干，决定毛发的直径[6]。因此，人真皮乳头细胞成为体外筛选脱发药物的首选细胞。考察药物对细胞生长的影响通常采用的方法有MTT法和MTS 法，这2种方法均是采用比色法检测细胞的生长，其原理是MTT和MTS试剂被活细胞内的脱氢酶产生的NADPH或NADH还原为有色的甲臜，而死细胞不能产生脱氢酶，因此，死细胞不能产生颜色。活细胞数量越多，产生的甲臜越多，培养基的颜色越深[7]，表明细胞增殖越旺盛。相对于MTT法，MTS法检测时间短，安全性高，重复性好[8]。因此，本文采用MTS法研究不同用量的吐温80对人真皮乳头细胞生长的影响，并考察在吐温80安全用量范围内白蜡及白蜡高级烷醇在水中的增溶量对人真皮乳细胞的增殖作用，为白蜡及白蜡高级烷醇产品的开发和利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白蜡及白蜡高级醇由本课题组提供；人真皮乳头细胞(批号2365)、真皮乳头细胞生长培养基(批号184)、包被液(批号361)、消化液(批号322)购自美国Cell Applications。非那雄胺(M1122A)购自大连美仑生物科技有限公司。吐温80(分析纯)购自天津市风船化学试剂科技有限公司。DMSO(批号：302A0328)购自北京索莱宝科技有限公司。倒置显微镜，日本基恩士，型号VHX-1000。

1.2 细胞培养

人真皮乳头细胞保存在液氮中，临用前从液氮中取出，在37℃水浴中融化后，转移到用包被液处理过的T-75培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱内培养过夜，第2天更换完全培养基，继续培养，待细胞融合度达到90%，用消化液消化，采用台盼蓝法测定细胞的活力，备用。

1.3 测试药液的配置

1.3.1 吐温80水溶液 将吐温80配制成浓度为5%(w/v)的水溶液，用灭菌水稀释成浓度250.00、125.00、62.50、31.25、15.60 μg·mL-1水溶液。

1.3.2 白蜡水溶液 将白蜡溶解到5%吐温水溶液中，制备成浓度1.00 mg·mL-1的白蜡水溶液(制备方法已申请专利)，用灭菌水稀释成浓度3.10、6.30、12.50、25.00、50.00 μg·mL-1的白蜡水溶液；

1.3.3 白蜡高级烷醇水溶液 将白蜡高级烷醇溶解到1%吐温水溶液中，制备成浓度2.00 mg·mL-1的白蜡高级烷醇水溶液(制备方法已申请专利)，用灭菌水稀释成浓度31.20、62.50、125.00、250.00、500.00 μg·mL-1的白蜡高级烷醇水溶液。

非那雄胺溶解到DMSO中配置成浓度0.74 μg·mL-1的溶液。

将上述溶液与培养基按1∶9混匀后，备用。

1.4 吐温80、白蜡及白蜡高级烷醇液对人真皮乳头细胞生长的影响

同时采用倒置显微镜观察细胞生长情况。

1.5 统计分析

采用SAS9.1统计软件中的ANOVA分析不同处理组细胞的增殖率和抑制率的平均值±SE，P<0.05表明有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同用量吐温80对人真皮乳头细胞生长的影响

不同字母表示不同处理组间差异显著(P<0.05,下同),A:阴性对照;B:非那雄胺;C:处理药剂中吐温80浓度1.56 μg·mL-1; D: 处理药剂中吐温80浓度3.12 μg·mL-1;E:处理药剂中吐80浓度6.25 μg·mL-1; F:处理药剂中吐温80浓度12.50 μg·mL-1; G:处理药剂中吐温80浓度25.00 μg·mL-1。Different lowercase were significantly different according to One-way analysis of variance(P<0.05,the same below).A: Negative control; B: Finasteride; C: Treatment agent including 1.56 μg·mL-1 tween80; D: Treatment agent including 3.12 μg·mL-1 tween80;E: Treatment agent including 6.25 μg·mL-1 tween80; F: Treatment agent including 12.5 μg·mL-1tween80;G: Treatment agent including 25.00 μg·mL-1 tween80.图1 不同处理吐温80对人真皮乳头细胞增殖的影响Fig.1 The proliferation of human dermal papilla cells in difference tween80

2.2 白蜡对真皮乳头细胞的增殖作用

A:阴性对照;B:非那雄胺;C:处理药剂中吐温80和白蜡的浓度分别为1.56、0.31 μg·mL-1;D:处理药剂中吐温80和白蜡的浓度分别为3.12、0.63 μg·mL-1;E:处理药剂中吐温80和白蜡的浓度分别为6.25、1.25 μg·mL-1;F:处理药剂中吐温80和白蜡的浓度分别为12.5、2.50 μg·mL-1;G:处理药剂中吐温80和白蜡的浓度分别为25.00、5.00 μg·mL-1.A: Negative control; B: Finastride; C: Treatment agent including 1.56 μg·mL-1 tween 80 and 0.31 μg·mL-1 white wax; D: Treatment agent including 3.12 μg·mL-1 tween80 and 0.63 μg·mL-1 white wax; E: Treatment agent including 6.25 μg·mL-1 tween80 and 1.25 μg·mL-1 white wax; F: Treatment agent including 12.5 μg·mL-1 tween80 and 2.50 μg·mL-1 white wax; G: Treatment agent including 25.00 μg·mL-1 tween80 and 5.00 μg·mL-1 white wax.图2 白蜡对人真皮乳头细胞的增殖作用Fig.2 The proliferation of human dermal papilla cells in difference white wax

2.3 白蜡高级烷醇对人真皮乳头细胞的增殖作用

A:阴性对照; B:非那雄胺;C:处理药剂中吐温80和白蜡高级烷醇的浓度分别为1.56、3.12 μg·mL-1;D:处理药剂中吐温80和白蜡高级烷醇的浓度分别为3.12、6.25 μg·mL-1;E:处理药剂中吐温80和白蜡高级烷醇的浓度分别为6.25、12.5 μg·mL-1;F:处理药剂中吐温80和白蜡高级烷醇的浓度分别为12.50、25.00 μg·mL-1;G:处理药剂中吐温80和白蜡高级烷醇的浓度分别为25.00、50.00 μg·mL-1.A: Negative control; B: Finastride;C: treatment agent including 1.56 μg·mL-1 tween 80 and 3.12 μg·mL-1 white wax; D: treatment agent including 3.12 μg·mL-1 tween 80 and 6.25 μg·mL-1 white wax; E: treatment agent including 6.25 μg·mL-1 tween 80 and 12.5 μg·mL-1 white wax; F: treatment agent including 12.5 μg·mL-1 tween 80 and 25.00 μg·mL-1 white wax; G: treatment agent including 25.00 μg·mL-1 tween 80 and 50.00 μg·mL-1 white wax.图3 白蜡高级烷醇对人真皮乳头细胞的增殖作用Fig.3 The proliferation of human dermal papilla cells in difference policosanol of white wax

3 讨论

4 结论

[1] 马李一, 王有琼, 张重权,等.虫白蜡还原法制备高级烷醇混合物研究[J]. 林产化学与工业, 2009,29(5): 6-10.

[2] 马李一, 王有琼, 张重权,等.虫白蜡制备高级烷醇工艺研究[J]. 食品工业科技, 2008,29(2): 179-181.

[3] Menendez R, Mas R, Amor AM,etal. Effects of policosanol treatment on the susceptibility of low density lipoprotein (LDL) isolated from healthy volunteers to oxidative modification in vitro[J]. British journal of clinical pharmacology, 2000,50(3): 255-262.

[4] Borg J. The neurotrophic factor, n-hexacosanol, reduces the neuronal damage induced by the neurotoxin, kainic acid[J]. Journal of neuroscience research, 1991,29(1): 62-67.

[5] 张 嘉, 李 澎, 李贻奎, 等.吐温80诱导RBL-2H3细胞脱颗粒作用研究[J]. 现代免疫学, 2009,29(3): 240-245.

[6] J. Lee, T. Tumbar. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling[J]. Seminars in cell & developmental biology, 2012, 23(8): 906-916.

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[8] 李红艳, 夏启胜, 徐 梅, 等. MTT、MTS、WST-1在细胞增殖检测中最佳实验条件的研究[J].中国康复医学杂志, 2005(11): 824-826.

[9] 程 欧, 高 鹏, 涂家生,等.吐温80质量与致敏性关系的研究[J]. 中国药科大学学报, 2010,41(3): 244-247.

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[12] 吴 懿, 朱容慧, 赵军宁,等. 3种表面活性剂对Caco-2细胞的细胞毒性研究[J]. 中药药理与临床, 2010,26(5): 157-158.

[13] 牛慧玲, 李庆忠, 陈志勇,等.含吐温80的不同注射剂溶血试验研究[J]. 中国药品标准, 2012,13(2): 108-111.

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(责任编辑：张 玲)

Effect of White Wax and Policosanol from White Wax Tween Aqueous Solution on HFDPCS

WANGZhan-di,FENGYing,LIXian,DINGWei-feng,MALi-yi,CHENXiao-ming

(Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Key laboratory of Cultivating and Utilization of Resources Insects of State Forestry Administration, Kunming 650224, Yunnan, China)

[Objective]To investigate the cell proliferation effect of white wax and policosanol from white wax tween aqueous solution in human dermal papilla cells (HFDPCs). [Method]The cell seeding density was decided by Trypan blue test. Next day, change fresh medium which including treatment agent for HFDPCs. MTS assay was used to compare the proliferation effects of different concentrations of tween80, white wax and policosanol from white wax tween80 aqueous solutions on HFDPCs tween aqueous solutionafter 48 h.[Result]HFDPCs could grow wellwhenthe concentration of tween 80 was 1.56-6.25 μg·mL-1. In the concentration range, white wax (solubility in water was from 0.31-1.25 μg·mL-1) and policosanol from white wax (solubility in water was 3.125-12.5 μg·mL-1) tween aqueous solutions had the cell proliferation effect for HFDPCs. In which, the white wax aqueous solution including 6.25 μg·mL-1tween80 and 1.25 μg·mL-1white wax, and the policosanol aqueous solution which including 6.25 μg·mL-1tween80 and 12.5 μg·mL-1policosanol increased significantly the proliferation of HFDPCs comparing with finasteride.[Conclusion]The selected concentration of tween80 is below 6.25 μg·mL-1in HFDPCs culture when tween80 is used as a solubilizing agent. In the optimistic concentration range of tween80, the white wax and policosanol from white wax could increase the proliferation of HFDPCs remarkably.

white wax; policosanol from white wax; tween80; human dermal papilla cells

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.006

2016-09-19

国家公益性林业科研专项(201204602);国家863项目(2014AA021800)

王占娣(1981—)，女，河北任丘，在读博士，主要从事资源昆虫研究.E-mail: zhdwang@163.com.
* 通讯作者.

S899.1

A

1001-1498(2017)01-0041-05