HPLC法测定蒙药复方五味清浊散中鞣花酸含量

苏都娜 策力木格 侯彦宏 图 雅 聂 波

1.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古医科大学蒙医药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；3.北京中医药大学东直门医院，北京 100027；4.中国中医科学院中医药发展研究中心，北京 100700；5.北京中医药大学东直门医院，中医内科学教育部和北京重点实验室，北京 100700

HPLC法测定蒙药复方五味清浊散中鞣花酸含量

苏都娜1策力木格2侯彦宏3图 雅4*聂 波5*

1.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古医科大学蒙医药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；3.北京中医药大学东直门医院，北京 100027；4.中国中医科学院中医药发展研究中心，北京 100700；5.北京中医药大学东直门医院，中医内科学教育部和北京重点实验室，北京 100700

目的：建立蒙药复方五味清浊散中的鞣花酸含量测定方法。方法：采用HPLC方法，色谱柱为依利特BETASIL (250mm × 4.6mm，5μm)，柱温40℃；流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)；流速1mL/min；检测波长为254nm。结果：蒙药复方五味清浊散中鞣花酸在3.1625～202.4μg/mL范围内与峰面积程良好线性关系。回归方程为：Y=67818X-253716，R=0.9997。平均加样回收率为99.61%，RSD=2.37%。结论：该方法简单、准确、重复性好，可用于测定蒙药复方五味清浊散中鞣质的含量。

蒙药复方五味清浊散；鞣花酸；HPLC；含量测定

五味清浊散为蒙医临床常用药之一，由全石榴、红花、豆蔻、肉桂、荜茇五味药等药物组成，具有开郁消食、暖胃的作用，临床用于治疗食欲不振、消化不良、胃脘冷痛、满闷嗳气、腹胀泄泻等病症。该复方收载于2015版《中华人民共和国药典》(一部)，但《药典》只有性状鉴别和薄层色谱法检查方法等，无含量测定方法[1]。五味清浊散中熊果酸、胡椒碱、没食子酸、荜茇明宁碱、红花羟基黄色素A、荜茇宁等的含量测定方法已有报道[2-8]，但其复方中主要药全石榴的有效成分鞣花酸的含量测定未见有报道。石榴含有多酚类、黄酮类、生物碱和有机酸及其他多种成分，其中具有代表性的化学成分有没食子酸、石榴皮鞣质、鞣花酸、安石榴苷、儿茶素、原花青素B1、原花青素B2、石榴皮素A、石榴皮素B等[9-12]。因此，研究五味清浊散中鞣花酸的HPLC测定方法，为完善其质量标准提供参考数据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-10Avp高效液相色谱仪(SPD-M10Avp紫外-可见二极管阵列检测器、Rheodyne 7725i手动进样阀、CTO-10ASvp柱温箱、2个LC-10ATvp输送泵，日本岛津)；超声波清洗器(新芝SB-5200)；超纯水机(美国ADVANTAGE 007NL0048)；电子天平(岛津AEG-40SM)。

1.2 材料 鞣花酸标准品(批号：R-004-151216，含量以98%为计，成都瑞芬恩生物科技有限公司)；五味清浊散(批号：20150140，阜新蒙药有限责任公司)。磷酸、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂依利特BETASIL C18(250mm×4.6mm，5μm)，柱温40℃；流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)，流速1mL/min；检测波长254nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 标准品溶液制备 取鞣花酸标准品精密称定，加入甲醇，超声溶解，补足甲醇至定量刻度，制成每1mL含鞣花酸202.4μg的标准品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液制备 取五味清浊散0.375g(约相当全石榴0.2g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，精密称定，超声40min，放冷至室温，精密称定，补足减失的溶剂，摇匀，用0.45μm滤膜过滤取续滤液，备用。

2.2.3 阴性供试品溶液制备 根据五味清浊散的处方和制法，制备成不含有全石榴的五味清浊散，当做鞣花酸标准品的阴性样品。取阴性样品适量(约相当于全石榴0.2g)，按供试品溶液制备的方法制备阴性供试品溶液。

2.3 线性关系 按2.2.1的制备方法制备并稀释成3.1625、6.325、12.65、25.3、50.6、101.2、202.4μg/mL的标准品溶液，分别各取5μL进样，以进样浓度(X)对峰面积(Y)的线性回归，回归方程为：Y=67818X-253716，R=0.9997，显示鞣花酸在3.1625～202.4μg/mL范围内与峰面积程良好线性关系。

2.4 精密度试验 按2.2.1的制备方法制备鞣花酸标准溶液，连续重复进样5次，记录鞣花酸的峰面积为精密度，RSD=1.84%。

2.5 干扰试验 在上述色谱条件下，取鞣花酸标准品溶液、阴性供试品溶液和五味清浊散供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪中，记录图谱，结果如图A、图B、图C所示。证明五味清浊散中的其他成分不会对鞣花酸的测定造成干扰。

2.6 重复性试验 按2.2.2的制备方法制备6份五味清浊散溶液，通过鞣花酸峰面积计算出质量浓度分别为88.52、87.82、87.16、90.48、87.16、87.48mg/mL，RSD=1.44%，计算得五味清浊散中鞣花酸的平均含量为11.75mg/g。

2.7 稳定性试验 按2.2.2的制备方法制备五味清浊散溶液，分别于0、0.5、1、2、4、9h内重复进样6次，按鞣花酸峰面积计算的RSD=1.94%，表明五味清浊散供试品溶液在9h内稳定。

2.8 加样回收率试验 精密称取9份五味清浊散0.15g，置具塞锥形瓶中，每3份分别精密加入鞣花酸溶液9.4mg、11.75mg、14.1mg，加入甲醇20mL，精密称定，超声40min，放冷至室温，精密称定，补足减失的溶剂，摇匀，用0.45μm滤膜过滤取续滤液，分别取5μL进样，测定鞣花酸峰面积，并计算回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果 (n=9)

2.9 含量测定 按以上方法分别制备鞣花酸标准品溶液与五味清浊散供试品溶液，外标法计算得五味清浊散(批号：20150140)中鞣花酸的含量，见表2。

表2 五味清浊散中鞣花酸含量 (n=4)

3 讨论

供试品溶液制备方法中五味清浊散的取样量(0.375g约相当全石榴0.2g)、提取溶剂及其用量(甲醇50mL)、促溶条件(超声40min)和在254nm波长处测定是参考文献[1、6]中的方法并经本试验验证可行后确定，但《中国药典》2015版中并没有表明柱温一项，本研究通过30℃、35℃、40℃、45℃的柱温条件的筛选，发现40℃柱温下出峰较好。

选用Agilent ZORBAX ODS(250mm×4.6 mm,5μm)和依利特BETASIL C18(250mm×4.6 mm，5μm)两种色谱柱，比较所得图谱后发现前者拖尾严重，因此选用后者。

五味清浊散是由全石榴400g，红花200g，豆蔻50g，肉桂50g，荜茇50g组成[1]，但其复方中主要药全石榴的有效成分鞣花酸的含量测定未见有报道，通过该方法可测定蒙药复方五味清浊散中鞣质的含量，并证明该方法简单、准确、重复性好。

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Mongolian Medicine Wuwei Qingzhuo Powders in the HPLC Method for Determination of Ellagic Acid Content

SU Duna1CEli Muge2HOU Yanhong3TU Ya4NIE Bo5*

1.Mongolian Medicine College of Pharmacy,Inner MongoliaUniversity for Nationalities,Tongliao 028000,China;2.Mongolian Medicine College of Pharmacy,Inner Mongolia Medical University,Huhehaote 010110,China;3.Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100027,China;4.Development Research Center of Traditional Chinese Medicine;China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100070,China;5.Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing,Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100070,China

Objective To establish an HPLC quantitative method for the Ellagic acid in Mongolian medicine Wuwei Qingzhuo powders.Methods HPLC was used for Ellagic acid.The chromatography column was Elite BETASIL C18(250mm×4.6mm,5μm) and the column temperature was 40℃.The mobile phase was acetonitrile-0.2%phosphoric acid(21∶79).The flow rate was 1mL/minand the detection wavelength was at 254nm．Results The regress equation for Ellagic acid was as the following:Y=67818X-253716(R=0.9997),and the linear range was 3.1625～202.4μg/mL.Theaverage recovery of Ellagic acid was 99.61%，RSD=2.37%.Conclusion This method is simple and convenient operation,is suitable for the Mongolian medicine Wuwei Qingzhuo powdersEllagic acid content determination.

Mongolian Medicine Wuwei Qingzhuo Powders;Ellagicacid;HPLC;Content Determination

国家自然科学基金项目面上项目-基于草乌减毒效应的诃子化学成分及缓和药性特征的相关研究(项目编号：81274192)。

苏都娜(1989-)，女，蒙古族，硕士研究生，研究方向为中药药效物质基础研究。E-mail：308381386@qq.com

聂波(1977-)，女，汉族，博士，副教授，研究方向为中药药理与中药体内代谢研究。E-mail：nieboww_1977@163.com

图雅(1966-)，蒙古族，博士，教授，研究方向为民族药(中药)药效物质基础研究及相关政策研究。E-mail：tuya126@126.com

R29

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1007-8517(2017)03-0040-03

2016-11-24 编辑：穆丽华)