藏药仁青芒觉和帮间久埃对金黄色葡萄球菌的增殖抑制作用

贺 平 旦增群培 王世华 袁东亚*

1.西藏民族大学医学院，陕西 咸阳 712082；2.西藏自治区达孜县章多乡卫生院，西藏 达孜 850100

藏药仁青芒觉和帮间久埃对金黄色葡萄球菌的增殖抑制作用

贺 平1旦增群培2王世华1袁东亚1*

1.西藏民族大学医学院，陕西 咸阳 712082；2.西藏自治区达孜县章多乡卫生院，西藏 达孜 850100

目的：观察分析藏药仁青芒觉和帮间久埃对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，为临床科学用药提供依据。方法：采用琼脂打孔法研究两种药物对6株金黄色葡萄球菌的抑菌作用，连续记录药物作用36h的菌液吸光度A600nm，绘制细菌生长曲线。结果：仁青芒觉、帮间久埃能够明显抑制金黄色葡萄球菌增殖，耐药菌株的抑菌圈直径与标准菌株基本一致。结论：二者对耐药性金黄色葡萄球菌均具有显著的抑菌作用，提示其较好的临床应用前景。

藏药；仁青芒觉；帮间久埃；金黄色葡萄球菌；抑菌作用

由于抗生素的不合理使用，导致耐药菌株不断出现并广泛传播，使药物对耐药菌株的临床疗效降低或无效，目前耐药菌株感染已经成为临床治疗的棘手问题。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界，是影响食品安全和化脓性感染中最常见的病原菌[1]。其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)自1961年在英国发现以来，现已遍及世界各地，成为全球重要的致病菌和研究热点[2]。

藏药是我国传统医药宝库的重要组成部分，在治疗感染性疾病方面有悠久的历史，而且药材资源非常丰富，故开发新型抗菌药物成为国内外研究的焦点。仁青芒觉系名贵藏药方剂，藏医巨著《四部医典》中记载：“中毒者特效芒觉也”，被誉为“解毒仙丹”[3]。仁青芒觉治疗食物中毒、腹泻、急慢性胃炎等消化系统疾病已有上千年的历史[4]。帮间久埃为藏医经典方剂，始载于藏医巨著《四部医典》，气微香，味甘、辛、苦，具有清热利肺、止咳化痰、平喘之功效[5]。两种药物临床疗效确切，但是药理机制研究甚少，本文探讨了二者对金黄色葡萄球菌的增殖抑制作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器 酶标仪(TECAN Sunrise)；BHC-1300Ⅱ超净工作台(苏净集团)；Dade AutoScan-4细菌鉴定系统；低温高速离心机(Thermo)、PH140A培养箱(上海一恒)；DENVER T-214电子天平；GZX-9070 MBE干燥箱、游标卡尺；YXQ-LS-75S压力蒸汽灭菌器(上海博讯)；ZH-2涡旋器。

1.2 药物 帮间久埃购于拉萨市雪域大药房(批号：2014206)；仁青芒觉购于西藏民族大学附属医院(批号：12479A)。标准药敏纸片：青霉素、卡那霉素、红霉素(康泰生物有限公司)。M-H琼脂和M-H肉汤(杭州微生物试剂有限公司)，内毒素检测用水(湛江博康海洋生物有限公司)。

1.3 受试菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923 (Staphylococcus aureus)由西安交通大学医学院提供。5株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌由咸阳市某医院检验科提供，菌株耐药情况由微生物自动分析仪鉴定。

2 方法

2.1 药物准备 用电子天平准确称量药物，在100mL纯水中浸泡30min，文火煮沸30min，冷却后4000转/分离心10min，取用上清液，然后用少量纯水冲洗沉渣两次并煮沸15min，冲洗液离心后取用上清液，最后将三次上清液混合并浓缩至1000mg/mL，用除菌滤器过滤后放置4℃备用。

2.2 抑菌圈测定 参照文献[6]用打孔器在琼脂平板上等距离打6个孔(孔径6.5mm)，将新鲜菌落配制的0.5～1.0比浊度的菌液均匀涂布于琼脂平板，每孔加100μL药液。设置600、200、60mg/mL三个浓度水平，卡那霉素与青霉素药敏纸片作为对照。37℃孵育24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。每株菌做三个平行，求取抑菌圈平均值。

2.3 对细菌生长曲线的影响 参考文献[7]略作修改，将受试菌株复苏活化，培养至对数生长期，按照1%接种至液体培养基，37℃250 转/分增菌培养30min；根据前期MIC结果[6,8]加入适量药液，使终浓度分别为0mg/mL、6.25mg/mL(0.5 MIC)、12.5mg/mL(1 MIC)、25mg/mL(2MIC)。以加入药物的时间为0h，间隔一定时间检测菌液吸光度A600nm。以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制金黄色葡萄球菌36h的生长曲线。

3 结果

3.1 药物抑菌作用 仁青芒觉和帮间久埃在3个浓度水平对6株金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌作用。抑菌圈直径大小与药物浓度呈正相关，同种药物不同剂量组之间的抑菌圈直径具有统计学差异(P<0.05)；两种方剂在相同浓度水平对金黄色葡萄球菌标准菌株和耐药菌株的抑菌圈直径基本一致，无统计学差异(P>0.05)。对于金黄色葡萄球菌耐药菌株，两种方剂的抑菌圈直径与青霉素组相比均具有统计学差异(P<0.05)。具体见表1。

表1 仁青芒觉对受试菌株的抑菌作用

注：“-”表示未形成抑菌圈；帮时间久埃抑菌数据自引于文献[6]。

3.2 仁青芒觉对细菌生长曲线的影响 图1直观地反映了仁青芒觉对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。与对照组相比，在6.25mg/mL时，仁青芒觉对金黄色葡萄球菌进入对数生长期(2h)和平台期的延续时间(8～24h)均没有显著改变；在12.5mg/mL时，延迟了细菌生长进入平台期的时间(12h)。当浓度提高至25mg/mL时，药物能够显著抑制细菌生长，未能形成对数期生长高峰。

3.3 帮间久埃对细菌生长曲线的影响 由图2可知，帮间久埃对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响与仁青芒觉相似。与对照组相比，帮间久埃在6.25mg/mL与12.5mg/mL时，对金黄色葡萄球菌进入对数生长期和平台期的延续时间并没有显著改变，其中12.5mg/mL组对细菌增殖略有抑制作用。当浓度提高至25mg/mL时，该药物能够显著抑制细菌生长，未形成对数期生长高峰。

4 讨论

藏医药是中国传统医药宝库中的璀璨明珠，在漫长的医药实践过程中形成了其独特的理论体系和浓厚的民族特色，具有悠久的历史和丰富的内涵[9]。藏药方剂仁青芒觉和帮间久埃对金黄色葡萄球菌的抑菌作用表明，两种药物的抑菌作用具有剂量依赖性，而且对标准菌株和耐药菌株均具有显著的抑菌效果，提示了较好的临床应用前景。与单一成分的抗生素不同，藏药方剂成分比较复杂，而且作用靶点较多，不易产生耐药性，为解决耐药性金黄色葡萄球菌感染问题提供了新的思路。细菌生长曲线显示仁青芒觉和帮间久埃能够显著抑制细菌生长繁殖，该结果与相关研究相似[7]，推测其增殖抑制作用与细菌结构破坏引起的核酸、蛋白质等重要成分有关，相关机制尚需进一步验证。

仁青芒觉由毛诃子、蒲桃、金腰草、檀香、西红花、珊瑚、珍珠、牛黄、麝香、熊胆、松石等加工制成[3]。帮间久埃由白花龙胆、檀香、诃子(去核)、余甘子、石灰华、广枣、丁香、肉豆蔻、沉香、巴夏嘎、无茎芥、甘草、毛诃子、木香、宽筋藤等药材组成[5]。在诸多组分中，诃子为独特的珍稀藏药材，具有广谱抗菌作用，研究证实诃子提取物对金黄色葡萄球菌具有显著抑菌作用[10]。此外，红花[11]、丁香[7,12]、甘草[13]等药材的提取物均对金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌作用。本文抑菌实验结果与上述方剂组分的报道相一致，为仁青芒觉和帮间久埃的深入研究提供了理论基础。藏医药是一个巨大的宝库，具有广阔的开发前景，仍需在深度和广度上不断进行研发。

[1]Lateef A, Oloke JK, Gueguimkana EB.The prevalence of bacterial resistance in clinical, food, water and some environmental samples in Southwest Nigeria[J].ENVIRON MONIT ASSESS, 2005, 100(1-3): 59.

[2]Das S, Dasgupta A, Chopra S.Drug repurposing: a new front in the war against Staphylococcus aureus[J].FUTURE MICROBIOL, 2016, 11(8): 1091.

[3]房少新，赵利平.藏药仁青芒觉中微量元素的测定[J].光谱实验室, 2013(2): 916.

[4]多吉，次仁巴珠.藏药仁青芒觉丸、十五味黑药丸及智托洁白丸对147例消化系统疾病的临床观察[C]//全国民族医药专科专病学术研讨会, 全国民族医药专科专病学术研讨会论文选编.中国广西北海，2001.

[5]张琦.十五味龙胆花丸与西药联用治疗成人咳嗽变异性哮喘57例分析[J].青海医药杂志, 2011(12): 58.

[6]贺平，朱晓莉，刘航，等.藏药十五味龙胆花丸的体外抑菌活性研究[J].中国民族民间医药, 2016(2): 3.

[7]彭苑霞，刘晓强，温羚玲，等.大黄等5味中药及单体成分对临床多重耐药菌的抑制作用[J].中国实验方剂学杂志, 2014(22): 103.

[8]Fang-yun S, Ping HE, Qun-ying HU.Study on antibacterial effect of Tibetan medicine Renqingmangjue in vitro[J].Acta Pharmacologica Sinica, 2013,34(1):113.

[9]贺平，袁东亚，孙芳云.藏药抑菌作用研究进展[J].中国民族医药杂志, 2015(6): 40.

[10]王双，王昌涛，都晓伟.诃子中活性物质的提取及其抗氧化、抑菌作用研究[J].食品与机械, 2010(6): 70.

[11]白亮亮，邹鸣峰，王恒，等.3种红花的体外抑菌作用研究[J].食品科技, 2015(2): 311.

[12]黄涵年，阙斐.肉桂、丁香、连翘挥发油联合抑菌作用研究[J].广州化工, 2016(11): 95.

[13]喻华英，唐萧.甘草提取物对奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌生物膜作用的研究[J].中华中医药杂志, 2015(9): 3374.

Antibacterial Activity of Tibet Medicine Renqingmangjue and Bangjianjiuai Pills Against Staphylococcus Aureus

HE Ping1Ten Zin Choe Phel2WANG Shihua1YUAN Dongya1*

1.Medical School, Xizang Minzu University, Xianyang 712082, China；2.Zhangduo Health-center of Dazi County, Dazi 850100,China

Objective To investigate the antibacterial activity of Tibetan medicine Medicine Renqing mangjue and Bangjianjiuai pills against Staphylococcus aureus and provide theoretical basis for clinical application.Methods M-Hagar-punching method was adopted to research the antibacterial activity of two drugs against 6 strains of S.Aureus.Furthermore, the absorbance of culture medium mixed with drug was continuously recorded for 36h and growth curve of S.aureus was drawn.Results Renqingmangjue and Bangjianjiuaipills had obvious inhibitory activity on bacterial proliferation.The diameters of inhibition zone weresimilar between standardS.Aureus and multidrug-resistant strains.Conclusion Two drugs had significant antibacterial effect on multidrug-resistantS.aureusin vitro,which indicated potential prospects in clinical application.

Tibetan Medicine; Renqingmangjue; Bangjianjiuai; Staphylococcus Aureus; Antibacterial Activity

西藏自治区自然科学基金项目(2015ZR-13-23；2015ZR-14-13)；西藏民族大学校级科研项目(14myQ14)。

贺平(1982-)，男，汉族，硕士，讲师，研究方向为藏药抑菌作用。E-mail:hepingyixue@126.com

袁东亚(1962-)，男，汉族，本科，教授，研究方向为藏药临床应用。E-mail: dy62@163.com

R29

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1007-8517(2017)03-0033-03

2016-11-16 编辑：穆丽华)