高血压前期合并糖尿病绝经前女性血管内皮功能改变的研究

杨震+姚顺+曾海+涛苏晨++陶军

摘要：目的 探讨糖尿病对高血压前期的绝经前女性内皮功能的影响。方法 选择40例年龄 （45.2±4.6）岁的人群作为研究对象，分为两组：高血压前期的绝经前女性患者（20例）与高血压前期合并糖尿病的绝经前女性（20例），使用超声技术评估血管舒张功能，通过使用流式细胞仪测定四组 CD34 和 KDR 双标阳性循环EPCs水平，ac-LDL 及 lectin 荧光标记方法评估体外培养EPCs数量，检测EPCs的迁移和增殖能力，同时研究血管舒张功能与EPC功能可能的关系。结果 高血压前期的绝经前女性相比合并糖尿病的高血压前期绝经前女性，内皮依赖的血流介导血管舒张功能（FMD）水平明显较高（P<0.05），而硝酸甘油酯介导的血管舒张功能（GMD）在两组受试者中未见明显差异（P>0.05）。与高血压前期的绝经前期女性相比，循环内皮祖细胞（EPCs）水平和培养的EPCs数量较合并有糖尿病的高血压前期绝经前女性明显要高（P<0.05）。循环EPCs的迁移和增殖功能在合并有糖尿病的高血压前期的绝经前女性要明显较非糖尿病的绝经前女性降低（P<0.05）。并且，FMD与循环EPCs水平呈明显线性相关，（r=0.56，P<0.05）及细胞培养试验（r=0.68，P<0.05），同时，FMD还与EPC迁移和增殖能力呈线性相关（r=0.61，P<0.05；r=0.57，P<0.05）。结论 以上结果说明糖尿病合并高血压前期的绝经前女性体内EPCs数量及功能以及血管舒张功能均下降，表现为内皮损伤修复能力降低及内皮功能下降，提示了该表现是血压升高及糖尿病的共同效应所致。

关键词：内皮祖细胞；高血压前期；绝经前期；糖尿病

高血压前期是正常血压与临床高血压之间的血压升高的过渡阶段，该阶段将增加心血管事件的发生，处于高血压前期的患者往往在未确诊临床高血压前已有潜在的靶器官损害。大量实验资料表明，来源于骨髓、外周血和脐血中的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）能够有效修复血管内皮损伤、参与促进血管新生以及改善内皮功能。相关研究发现，心血管事件危险因素如高血压前期，EPCs的数量和活性会下降，这可能导致内皮损伤的发生与发展[1]。大量研究表明，糖尿病会导致心脑血管事件并发症的风险增加，这可能与糖尿病导致的血管内皮损伤及内皮功能障碍有关。

我们前期研究表明，绝经前女性体内EPCs维持在较高水平，这与体内的一定水平的雌激素相关，同时表明了绝经前女性血管损伤修复能力及内皮功能维持在一定水平。然而目前尚不清楚糖尿病合并血压升高是否会对该类患者血管内皮功能造成更明显的不利效应，所以该研究旨在明确糖尿病合并血压升高对该类患者内皮功能的具体影响，为临床加强筛查与防治高血压前期合并糖尿病的绝经前女性患者提供理论依据。

1 资料与方法

1.1材料与试剂 CD34流式细胞荧光抗体购于BD公司，EGM-2培养基购于Clonetics公司，纤维连接蛋白购于Hematologic Technologies公司，ac-LDL购于Molecular Probes公司，Lectin购于Sigma公司，二苯基四氮唑溴盐（MTT）购自Fluka公司。

1.2研究对象 我们招募了40例年龄 （45.2±4.6）岁志愿者，分为两组：绝经前高血压前期的女性患者（20例）及高血压前期合并糖尿病的绝经前女性（20例）。高血压前期按照 JNC8 指南的标准：收缩压120～139 mmHg 和/或舒张压80～89 mmHg。依据美国糖尿病协会专家委员会报告指南，对新近诊断且未进行药物治疗的高血压前期合并2型糖尿病的女性进行诊断。并且排除了心血管疾病、恶性肿瘤、感染或炎症性疾病，以避免对循环EPCs数量和功能产生影响；孕妇、哺乳期妇女、子宫切除及吸烟者不纳入本研究。所有志愿者通过询问病史、详细的体格检查和实验室检查。

1.3流式细胞仪测定循环EPCs水平 取200 μl外周血与FLK-1流式细胞荧光抗体一抗孵育20 min，再加入FLK-1二抗孵育20 min，之后加入CD34 流式细胞荧光抗体孵育20 min。最后将红细胞溶解，剩余细胞用20 g/L多聚甲醛固定，以流式細胞仪进行检测，CD34和KDR双阳性细胞为循环EPCs。

1.4荧光标记方法评估培养EPCs数量 取各组外周血约20 ml置于肝素管中，并以PBS稀释。加入Ficoll-Pague分离液后离心，小心提取血清和Ficoll分离液交界处的单个核细胞层，置于以纤维连接蛋白预衬的EGM-2培养基中。将上述含有外周血单个核细胞的培养基置于含有体积分数5%CO2、37 ℃孵箱中培养，在倒置荧光显微镜下动态观察细胞形态学变化。细胞培养2 w后取一部分贴壁细胞在一定浓度乙酰化低密度脂蛋白溶液中孵育1 h，之后20 g/L多聚甲醛固定，以一定浓度凝集素抗体溶液孵育1 h，并置于荧光显微镜下观察拍片，红色和绿色双染色细胞为EPCs。

1.5 EPC迁移能力检测 将含 50 ng/ml VEGF 的DMEM 培养液加入改良 Boyden 小室的下室， 用 2.5 g/L 胰酶消化贴壁细胞，悬浮于DMEM 培养液中。将含50 ng/ml悬浮在 500ul DMEM 培养液注入上室，培养24 h后，轻轻刮去滤膜上面的未迁移细胞，用甲醇固定，Giemsa 溶液染色，计数迁移的细胞。

1.6 EPC能力增殖检测 EPC培养7 d后，如上述用0.25%胰酶消化贴壁细胞，悬浮于DMEM培养液中。将相同数量的EPC接种到包被有人纤维连接蛋白96孔培养板，每孔加10μL MTT （5 g/L），培养4 h后，弃去上清液，再加入二甲基亚砜（150 μL/孔）充分振荡10 min后，在酶标仪下于波长490 nm处测A值。

1.7血管舒张功能检测 通过高分辨率超声，使用5～12 MHz的线性探头，基于HDI5000系统（Wshington，USA），使用5-12 MHz频率探头的线性阵列传感器对肱动脉的血流介导的血管舒张功能（FMD）进行测量。受试者仰卧位休息15 min后，对其肘窝附近20～100 mm的肱动脉进行测量。用血压计对受试者前臂上端施加250 mmHg的压力，持续5 min，对血压计进行放气，之后在反应性充血55～65 s后通过对平均舒张期管径增加百分比对FMD进行测定。15 min后，给予受试者450 μg硝酸甘油舌下含服，5 min后再对硝酸甘油介导的血管舒张（GMD）管径进行测定。

1.8主要观察指标 观察两组循环EPCs的数量，检测EPCs的迁移和增殖能力，检测FMD及分析其与EPCs的关系。

1.9统计学分析 采用SPSS 11.0 统计学软件进行数据分析，图表结果以（x±s）表示；组间差异采用方差分析及两两比较，FMD和EPCs数量或功能增加水平之间关系采用单因素直线相关分析，P<0.05 为差异表示有显著性意义。

2 结果

2.1两组FMD与GMD比较 超声技术检测显示，与非糖尿病高血压前期的绝经前女性相比，糖尿病患者FMD水平明显下降（P<0.05）。然而， GMD水平在两组患者中没有明显差异（P>0.05）。

2.2两组循环EPCs数量比较 与高血压前期的绝经前期女性相比，循环内皮祖细胞（EPCs）水平和培养的EPCs数量较合并有糖尿病的高血压前期绝经前女性明显要高（P<0.05）。

2.3两组循环EPCs功能比较 循环EPCs的迁移和增殖功能在合并有糖尿病的高血压前期的绝经前女性要明显较非糖尿病的绝经前女性降低（P<0.05）。

2.4两组FMD与循环EPCs数量或功能的关系 通过流式细胞仪分析可以发现，FMD与循环EPCs水平呈明显线性相关（r=0.56，P<0.05）及与培养EPCs数量呈线性相关（r=0.68，P<0.05），同时，FMD还与EPC迁移和增殖能力呈明显线性相关（r=0.61，P<0.05；r=0.57，P<0.05）。

3 讨论

本文的研究结果表明，高血压前期合并糖尿病将使绝经前女性患者内皮功能明显受损，患者体内循环EPCs水平下降，内皮依赖性血流介导的血管舒张功能降低，提示患者血管内皮损伤修复能力下降。本研究通过EPCs水平、培养的EPCs数量，FMD、GMD以及FMD与EPC数量和功能的关系对血管内皮功能进行评估。近来研究表明，在骨髓和外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞-内皮祖细胞，是血管内皮损伤修复重要的细胞生物学机制[2]。在血管内皮损伤发生后，內皮祖细胞能归巢至损伤血管内皮局部，再生损伤局部的内皮细胞，在心血管危险因素如动脉粥样硬化，肥胖，抽烟影响下，EPCs水平与功能则会下降。FMD是高分辨率超声技术实现的无创检测内皮功能受损的精确度、可重复性高的检测指标。本研究中发现FMD与EPCs水平及功能呈线性相关，提示了内源性血流介导的血管舒张功能与内皮修复能力具有明显相关性。

高血压前期患者体内循环EPCs数量减少，迁移和增殖能力减弱，导致内皮细胞得不到及时修复及更新，血管内皮受损修复能力下降[3]，最终加重高血压血管损伤及靶器官损害的发生。然而高血压前期的绝经前期女性体内循环EPCs的数量和活性却维持在正常水平，这与体内维持一定水平的雌激素有关[4]。目前尚不清楚糖尿病合并血压升高是否会对该类患者血管内皮功能造成更明显的不利效应，因此，本研究是首次探讨糖尿病合并高血压前期绝经前女性的血管内皮功能改变的研究。

总之，本研究发现糖尿病合并高血压前期的女性内皮功能下降，提示了注重筛查此类患者，及时控制及减少心血管疾病危险因素，改善血管舒张功能，提高循环EPCs的数量和活性继而修复损伤的血管内皮，对于该类患者防治心血管疾病具有非常重要的意义。

参考文献：

[1]Fox CS. Cardiovascular disease risk factors， type 2 diabetes mellitus， and the Framingham Heart Study[J].Trends Cardiovasc Med，2010，20： 90-95.

[2]Yoder MC. Is endothelium the origin of endothelial progenitor cells[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（6）：1094-1103.

[3]Herrmann JL，Abarbanell AM， et al.Gender Dimorphisms in Progenitor and Stem Cell Function in Cardiovascular Disease[J].J Cardiovasc Transl Res，2010，3（2）： 103-113.

[4]蒋艳萍，曾高峰，任姿，等.高血压前期循环内皮祖细胞数量和功能的性别差异[J]. 中国组织工程，2015，19（1）：3061-3066.

编辑/蔡睿琳