超高效液相色谱法测定糜子中4种B族维生素

田翔，王海岗，乔治军

（1.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与

遗传改良山西省重点实验室，山西太原030031；2.山西省农业科学院，山西太原030031）

超高效液相色谱法测定糜子中4种B族维生素

田翔1，王海岗1，乔治军2

（1.山西省农业科学院农作物品种资源研究所，农业部黄土高原作物基因与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与

遗传改良山西省重点实验室，山西太原030031；2.山西省农业科学院，山西太原030031）

建立同时测定糜子中4种B族维生素的超高效液相色谱法。糜子样品用0.01 mol/L盐酸超声加热溶解，醋酸锌沉淀蛋白后提取滤液，采用Waters HCLASS超高效液相色谱仪，以C18柱为固定相，乙腈-1%甲酸溶液（pH＝2.63）为流动相，流速0.25 mL/min梯度洗脱，利用紫外检测器在波长275 nm处进行检测，分析时间为11 min。结果表明，维生素B1，B2，B6，B9这4种维生素线性关系良好，R2均在0.999以上，相对标准偏差（RSD）为0.42%～1.56%，回收率范围为91.70%～101.02%。该法快速简便，精密度好，结果准确可靠，适用于同时测定糜子中水溶性维生素的含量，可对糜子营养品质进行评价，鉴选优良种质。

糜子；超高效液相；维生素B

糜子的基本结构由4个部分组成，包括含有纤维素的麸皮，含较丰富营养素的糊粉层，含大量淀粉的胚乳，富含蛋白质、脂肪、矿物质、B族维生素和维生素E的谷胚[1]。糜子作为常见的谷物，是人们膳食金字塔中最基础的部分，其最突出的营养特点是含有丰富的B族维生素。

B族维生素是水溶性维生素中重要的一类，其中多种是酶的辅基和酶的组成部分[2]。当人体内缺乏B族维生素时，可导致多种疾病的发生，而人体自身又无法合成这些化合物，必须通过食物或服用复合维生素制剂给予补充。随着人们对生活品质要求的提高以及复合维生素制剂及高档营养品的出现，测定谷物中B族维生素的含量引起了人们的广泛关注。已有的B族维生素检测方法很多[3-4]，如荧光法、微生物法、分光光度法、自动测定法、高效液相色谱法[5-7]和高效毛细管电泳法[8]等。这些方法多是针对某个单一维生素的测定，且超高效液相色谱法用于糜子中B族维生素的测定还未见报道。

本研究采用HPLC建立了糜子中B族维生素的测定方法，对样品前处理方法进行了研究，并对仪器测定条件各影响因素进行了优化。该方法简便快速，准确可靠，对糜子样品中水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

维生素B1（硫胺素）、维生素B2（核黄素）、维生素B6（盐酸吡多醇）、维生素B9（叶酸）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲酸、甲醇均为色谱纯；氢氧化钠、盐酸、三氟乙酸、磷酸二氢钾、醋酸锌及辛烷磺酸钠均为优级纯。实验用水均为二次蒸馏水。样品材料为山西省农业科学院农作物品种资源研究所提供的山西河曲红糜子。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪（Waters HClass，美国waters）；色谱柱：C18（2.1 mm×100 mm，1.8 m）；电子天平（BSA124S，德国Sartorius）；高速离心机（5804R，德国Eppendorf）；恒温水浴锅（HHS，上海博讯）；漩涡混合器（VORTEX-5，海门市其林贝尔）。

1.3 实验方法

1.3.1 维生素标准储备液的配制分别准确称取10 mg维生素B1，B6标准品于25 mL棕色容量瓶中，加入15 mL浓度为0.01 mol/L的盐酸溶液并充分振荡，超声15 min，待全部溶解后，用0.01 mol/L的盐酸溶液定容，即得质量浓度为0.4 mg/mL的储备液[9]。

分别准确称取7.5 mg维生素B2，B9标准品于25 mL棕色容量瓶中，先用1.5 mL浓度为2 mol/L的NaOH溶液溶解后，再加0.01 mol/L的盐酸溶液定容，超声15 min，即得质量浓度为0.3 mg/mL的储备液。低温避光保存。

1.3.2 超高效液相色谱（UPLC）分析条件色谱柱为C18；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸（pH＝ 2.63）；柱温20℃；紫外检测器，波长275 nm；进样体积5 μL；流速0.25 mL/min，采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如表1所示，分析运行时间11 min[10-12]。

表1 梯度洗脱程序

1.3.3 工作曲线的绘制分别吸取一定量的4种标准储备溶液配成不同系列的浓度，于2 mL离心管中配成0.05～2 g/mL的混标溶液。按照1.3.2中的条件进样，以峰面积对质量浓度绘制标准曲线，得到4种维生素的线性方程，并以3倍信噪比计算相应的检出限[13]。

1.3.4 样品预处理方法准确称取5 g样品置于50 mL离心管中，用20 mL 0.01 mol/L的盐酸溶解，于50℃超声提取2 h，加入2 mL 15%醋酸锌混匀，以4 000 r/min离心10 min。用吸管吸取上清液置于另一个50 mL的离心管中，对残渣按照上述步骤再次加入20 mL提取液重复提取一次，合并提取液于50 mL离心管中，用水定容，混匀，取滤液过0.22 μm水系滤膜，待上机[14-15]。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相选择流动相的pH值对这4种水溶性维生素的保留时间有影响，pH值越大，保留时间越短，但考虑到柱子的耐酸范围，确定pH值为2.63时最佳。

考虑到流动相的选择对维生素的色谱分离效果影响较大，分别选择了乙腈-0.01%三氟乙酸、甲醇-辛烷磺酸钠及乙腈-0.1%甲酸作为流动相。实验结果表明，利用乙腈-0.01%三氟乙酸作为流动相对混标液中4种维生素进行分离测定时，色谱峰发生重叠，分离效果较差。辛烷磺酸钠溶液本身色谱峰值较大且保留时间长，对体系干扰较大。乙腈-0.1%甲酸作为流动相能较好地实现混标液中4种维生素的分离，结果如图1所示。从图1可以看出，乙腈-0.1%甲酸为流动相的分离效果较好，各维生素的出峰顺序为：维生素B1、维生素B6、维生素B9、维生素B2。

2.1.2 紫外检测波长的选择将4种水溶性维生素分别在190～700 nm处作紫外光谱扫描，得到各物质的最大吸收波长，维生素B1为244 nm，维生素B2为266 nm，维生素B6为288 nm，维生素B9为280 nm。当以乙腈-0.1%甲酸为流动相，紫外检测波长分别为260，275，280 nm时对混标进行分离。结果表明，波长调整后所有维生素的色谱峰积分面积均减小。因此，275 nm为合适波长。

2.1.3 流速对色谱分离效果的影响乙腈-0.1%甲酸为流动相，考察了流速分别为0.4，0.3，0.25mL/min时混标的分离效果。结果表明，当流速为0.25mL/min时分离效果最佳。

2.1.4 梯度洗脱条件在设定流动相A和B在不同组成比例下的洗脱状况，根据4种维生素色谱峰的峰形、分离度和色谱分析时间，确定了流动相A，B在梯度起始和结束时的组成比例以及洗脱程序[16]。色谱条件：流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸，在4min内增加乙腈比例可以明显缩短检测时间，并增大分离度。

2.2 单标的UPLC图谱

在最优条件下扫描4种维生素标准品的UPLC图谱，维生素B1，B6，B9，B2标准品的UPLC保留时间依次为0.520，0.990，5.572，6.019 min。

2.3 标准曲线、线性范围和检出限

以标准溶液浓度为横坐标c，峰面积为纵坐标y，得到回归方程[17]。4种水溶性维生素均具有良好的线性，R2＞0.999，满足检测需要。方法的线性回归方程、相关系数及检出限结果列于表2。在本试验方法所确定的实验条件下，取一系列标准溶液进行超高效液相色谱测定，以峰面积y对浓度c（μg/mL）做图，找出线性关系，并确定方法的最低检测限。

表2 4种维生素的线性回归方程与检出限

2.4 精密度与回收率

本研究方法的回收率实验选用已知B族维生素含量的糜子样品为基质，设定了3个添加水平，对每个浓度样品进行6次重复实验[18]，测得4种水溶性维生素回收率和相对标准偏差（RSD）。维生素B1，B2，B6，B9的RSD分别为1.32%，0.42%，1.56%和0.92%，测定回收率分别为96.34%，97.01%，91.70%和101.02%，其回收率在91.70%～101.02%，测定结果的相对标准偏差（RSD）小于2%。

2.5 实际样品检测

分别用所建立的超高效液相色谱法测定糜子样品中的水溶性维生素，得到的实际测定数据与国标法实测值进行比较，结果表明，相对误差在1.5%～2.1%，均在允许范围内，说明此法测得的糜子样品的数据准确可靠，适用于糜子及谷物中水溶性维生素的同时测定。糜子中维生素B1，B2，B6，B9的含量分别为1 233.838，326.191，1 759.678，724.676 μg/100 g（图2）。

3 结论

本实验建立了同时进行测定糜子中的维生素B1，B2，B6，B9等4种水溶性维生素UPLC法，样品经0.1%甲酸超声提取，醋酸锌沉淀蛋白，通过UPLC进行检测，11 min内可完成4种水溶性维生素含量的测定，通过对高效液相色谱法条件的优化，控制流动相的pH值，可明显地改善峰形和分离度，使用超高效液相色谱仪后缩短了保留时间，提高了检测的准确度、精密度[19-20]。测定结果与国标法测定数据相比，结果均在允许范围内，可对较宽浓度范围内的糜子多种水溶性维生素进行同步分析，有助于提高糜子检测的分析效率，降低成本，丰富糜子水溶性维生素品质评价体系，鉴选糜子优良种质。

4 讨论

本研究将糜子中的4种B族维生素分离分析，实验中提取温度过高和光照对B族维生素可能产生破坏，但低温提取率降低，因此，选择酸性条件下超声提取，也有用淀粉酶和高温压力提取技术，本实验的提取条件较为简单可操作。今后应对糜子中的其他水溶性有机物进行定性定量研究，对提取方法进行探索，尽量避免其他物质如色素等产生，本研究只是一个初步结果，今后将对糜子中的B族维生素化合物进行全面探索研究。

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Simultaneous Determination of Four Water-soluble B Vitamins inPanicum miliaceumL.by Ultra Performance Liquid Chromatography

TIANXiang1，WANGHaigang1，QIAOZhijun2
（1.KeyLaboratoryofCrop Gene Resources and GermplasmEnhancement on Loess Plateau，MinistryofAgriculture，Shanxi Key LaboratoryofGenetic Resources and Genetic Improvement ofMinor Crops，Institute ofCrop GermplasmResources，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

To establish simultaneous determination of 4 kinds of water-soluble vitamin B in Panicum miliaceum L.used by ultra performance liquid chromatography（UPLC）,samples were dissolved by ultrasonic heating with 0.01 mol/L of hydrochloric acid and filtrate was extracted after protein was precipitated byzinc acetate.C18was stationary phase and acetonitrile-1%formic acid solution was moving phase.Gradient elute was done at the rate of 0.25 mL/min.Detection was done at 275 nm of wave length used by ultraviolet detector and analysis time was 11 min.The result showed that linear relations of vitamin B1,vitamin B2,vitamin B6,and vitamin B9were good.Average value of R2was over 0.999.Relative standard deviation was 0.42%-1.56%,while recovery rate was 91.70%-101.02%. The method is fast,convenient,accurate and reliable,can be applied in determining content of water soluble vitamin and appraising and selectingexcellent Panicum miliaceum L.germplasmresources.

Panicum miliaceum L;UPLC;vitamin B

S516

A文献标识码：1002-2481（2017）02-0183-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.08

2016-07-14

现代农业产业技术体系建设专项（CARS-07-13.5）；山西省农业科学院攻关项目（ygg1514）

田翔（1982-），女，山西太原人，助理研究员，硕士，主要从事农作物品质分析研究工作。乔治军为通信作者。