高渗氯化钠羟乙基淀粉40对大鼠脑缺血再灌注损伤后MMP-9和层粘连蛋白表达的影响

刘星芳， 张秀梅， 赖丽娟， 舒 鹏， 黄志华， 占丽芳， 单热爱4，， 黄 诚

高渗氯化钠羟乙基淀粉40对大鼠脑缺血再灌注损伤后MMP-9和层粘连蛋白表达的影响

刘星芳1， 张秀梅1， 赖丽娟1， 舒 鹏2， 黄志华3，4， 占丽芳5， 单热爱4，5， 黄 诚3，4

目的 探讨高渗氯化钠羟乙基淀粉40(HSH)对大鼠脑缺血-再灌注(I/R)损伤后神经功能行为学评分，脑水肿情况，脑梗死体积以及脑组织中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和层粘连蛋白(Laminin)表达的影响。方法 48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、实验1组、实验2组。大鼠局灶性脑I /R损伤模型制备成功后120 min，假手术组和模型组静脉输注0.9%生理盐水，实验1组和2组分别静脉输注HSH 4 ml/kg和8 ml/kg。再灌注24 h后，行神经功能行为学评分，观察脑水肿情况，TTC染色测算脑梗死体积，用免疫印迹方法检测缺血区脑组织MMP-9和Laminin的表达。结果 与假手术组比较，模型组神经功能行为学评分升高(P<0.001)；脑水肿加重；脑梗死体积增加(P<0.001)；MMP-9蛋白表达升高(P<0.05)；Laminin蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较，实验1组和2组神经功能行为学评分降低(P<0.001)；脑水肿缓解；脑梗死体积减少(P<0.001)；实验1组MMP-9蛋白表达减少(P<0.01)，Laminin蛋白表达升高(P<0.05)；实验2组MMP-9蛋白和Laminin蛋白表达均无明显变化。结论 用HSH治疗大鼠脑I /R损伤后，大鼠神经功能行为学评分改善，脑水肿减轻，脑梗死体积减小，血脑屏障通透性降低，其机制可能与降低MMP-9和增加Laminin蛋白的表达有关。且保护作用以4 ml/kg剂量效果更佳。

脑缺血再灌注损伤； 高渗氯化钠羟乙基淀粉40； MMP-9； Laminin

高渗氯化钠羟乙基淀粉(HSH)是一种血容量扩充药，它具有减轻组织水肿、改善微循环、提高晶体与胶体渗透压的优点[1]。课题组前期研究表明，HSH对脑缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤有保护作用[2～4]，且降低脑组织含水率。因此，HSH很可能通过保护血脑屏障起作用。本实验通过TTC染色观察脑梗死体积及检测血脑屏障相关蛋白MMP-9和Laminin，进一步探讨HSH对大鼠急性脑I/R损伤后血脑屏障的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠24只(购自赣南医学院实验动物中心)，体重250～300 g，随机均分成假手术组、模型组、实验1组(4 ml/kgHSH)和实验2组(8 ml/kgHSH)。

1.2 脑缺血再灌注损伤模型制备 大鼠用10%的水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，模型组、实验1组和实验2组采用大脑中动脉拴线法[5，6]制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，将一尼龙线(长4 cm，直径0.26 mm)经颈总动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进18～20 mm感到轻微阻力时，达到大脑前动脉，阻断大脑中动脉的所有血液供应，120 min后，拔出尼龙线，缝合皮下组织和皮肤，完成脑缺血再灌注损伤模型。假手术组仅需要暴露和分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不闭塞大脑中动脉。术中严格控制室温在23～25 ℃。实验动物在脑缺血120 min后，假手术组和模型组经舌下静脉输注0.9%生理盐水4 ml/kg，实验1组和2组分别从舌下静脉输注HSH 4 ml/kg和8 ml/kg，均于30 min内微量泵恒速输完。大鼠苏醒后，放回鼠笼。

1.3 神经功能行为学评分 再灌注24 h后，参照Longa氏评分标准[5]进行神经功能行为学评分。0分：未观察到神经功能缺陷症状；1分：轻度局灶性神经功能缺陷，不能完全伸展手术对侧前爪；2分：中度局灶性神经功能缺陷，向手术对侧转圈；3分：重度神经功能缺陷，向手术对侧倾倒；4分：不能行走，意识昏迷。

1.4 TTC染色观察脑梗死体积 大鼠断头取脑后，-20 ℃冰冻3 min后，以矢状缝后人字形分叉点为起始标记点切成1.0～2.0 mm厚(6片/只)脑片置于2%氯化2、3、5-三苯基四氮唑溶液中，37 ℃避光温育30 min，然后移至PBS配制的4%多聚甲醛液中固定，脑梗死区呈白色，照相。

2 结 果

2.1 HSH对脑缺血再灌注损伤后神经功能行为学评分、脑水肿和脑梗死体积的影响 与假手术组比较，模型组神经功能行为学评分增高(P<0.001)，脑水肿情况明显，脑梗死体积增加(P<0.001)。与模型组比较，实验1组和2组神经功能行为学评分降低(P<0.001)，脑水肿情况缓解，脑梗死体积减小(P<0.001)(见表1和图1、2)。

2.2 HSH对脑缺血再灌注损伤后MMP-9和Laminin蛋白的表达的影响 与假手术组比较，模型组损伤侧脑组织中MMP-9蛋白的表达明显增多(P<0.05)，Laminin蛋白表达明显降低(P<0.01)；与模型组比较，实验1组损伤侧脑组织中MMP-9蛋白的表达减少(P<0.01)，Laminin蛋白表达升高(P<0.05)，实验2组MMP-9蛋白和Laminin蛋白表达均无明显变化(见图3，图4)。

组别神经功能评分(分)脑梗死体积(%)假手术组模型组实验1组实验2组02.5±0.5*0.9±0.8△1.6±0.5△029.9±0.6*2.9±0.4△5.7±0.4△

与假手术组比较*P<0.001；与模型组比较△P<0.001

图1 各组脑水肿情况

图2 各组TTC染色脑梗死范围的影响

与假手术组相比*P<0.05；与模型组相比##P<0.01

与假手术组相比**P<0.01；与模型组相比#P<0.05

3 讨 论

高渗氯化钠羟乙基淀粉40(HSH)为复方制剂，含10.5 g 4.2%氯化钠+19 g 7.6%羟乙基淀粉40，数字模型下晶胶最合适比例。前期研究表明，在大鼠脑缺血再灌注损伤模型中HSH可降低缺血区脑组织iNOS活性、减少NO含量[2]；提高大鼠脑I/R的抗氧化作用、增强氧自由基的清除[3]；使脑组织Ca+-Mg+-ATPase活性的升高可促进Ca+向内质网转运，降低细胞内的Ca+浓度，从而对抗脑缺血-再灌注损伤所致的钙超载，保护脑细胞[4]。本实验结果也发现，HSH可以改善大鼠脑缺血再灌注损伤后的神经功能行为学评分、脑水肿情况以及脑梗死体积。

基质金属蛋白酶(MMPs)是调控脑内基质最重要的酶系统之一，MMPs介导紧密结合蛋白的降解是早期BBB损伤的一个重要机制[7]。其中MMP-9与脑缺血水肿时血脑屏障的破坏关系最为密切，它能降解和重塑细胞外基质，促进血管内皮细胞和平滑肌细胞的聚集和迁移，调节细胞增殖和凋亡，参与血管反应的病理生理过程以及神经血管的再生和重塑[8]。脑缺血时，MMP-9被诱导激活，通过降解紧密连接蛋白和基底膜成分[9]导致血管壁完整性破坏，从而增加BBB通透性，导致血管源性水肿、白细胞浸润和出血性转化，加重神经功能缺损[10]。本实验发现，模型组中MMP-9蛋白的表达明显升高，这可能是因为缺血再灌注损伤诱发炎症反应或者氧自由基，刺激MMP-9的基因转录，从而导致MMP-9合成增加。而HSH实验组的大鼠MMP-9蛋白的表达明显低于模型组。HSH可能通过同时提高晶体和胶体的渗透压，减轻脑水肿，改善脑血供，从而减少MMP-9的表达。

Laminin主要存在于基底膜结构中，是基底膜所特有的非胶原糖蛋白。Laminin的主要功能是作为基底膜的主要结构成分对基底膜的组装起关键作用，在细胞表面形成网络结构并将细胞固定在基底膜上。在缺氧或炎症导致的BBB功能障碍中，Laminin作为一个关键分子参与了BBB损伤后的修复[11]。由于Laminin是MMP-9的主要作用底物，所以在脑缺血损害中Laminin的降解可破坏BBB的完整性，加重BBB的损害[12]。本实验显示，脑缺血再灌注损伤后Laminin蛋白的表达明显降低，这和MMP-9的表达成负性相关。这更说明了，可能是脑缺血再灌注损伤导致的水肿和炎症等因素造成MMP-9合成增多从而使Laminin的降解也增多。而HSH实验组中的Laminin的表达明显升高，故认为HSH保护血脑屏障，减轻脑水肿也与Laminin表达增加有关，除可能因MMP-9表达降低，Laminin破坏减少，HSH是否可以直接刺激Laminin表达增加尚未见报道。

HSH实验组中，4 ml/kg组比8 ml/kg组效果更好，可能原因是8 ml/kg的剂量对于脑缺血再灌注大鼠来说容量负荷过大，减弱了对脑组织细胞的保护作用。也可能因为BBB严重破坏导致HSH在两侧的梯度渗透压减弱，只有在HSH的有效窗才能取得平衡，且与BBB的损伤程度成反比[13]。

本研究结果表明，脑缺血再灌注损伤后，MMP-9蛋白表达的升高和Laminin蛋白表达的减少参与了其病理变化，促进BBB的损伤，使得大鼠神经功能行为学评分和脑梗死体积等均增加，脑水肿明显。早期给予HSH治疗可能通过减少MMP-9蛋白的表达，增加Laminin蛋白的表达对缺血再灌注脑损伤具有一定程度的保护作用。

[1]张义轩，杨素霞，王 勇，等. 高渗氯化钠羟乙基淀粉40注射液对颅内压的影响[J]. 中华神经外科杂志，2008，24(7)：486-486.

[2]单热爱，周树保，黄志华，等. 高渗氯化钠羟乙基淀粉40对大鼠脑缺血再灌注损伤后一氧化氮及其合酶的影响[J]. 广东医学，2011，32(9)：2510-2511.

[3]单热爱，毕瑞荥，占丽芳，等. 高渗氯化钠羟乙基淀粉40在大鼠脑缺血-再灌注损伤中的抗氧化作用[J]. 中风与神经疾病杂志，2012，29(12)：1087-1088.

[4]单热爱，占丽芳，周树保，等. 高渗氯化钠羟乙基淀粉40对大鼠脑缺血-再灌注损伤后ATP酶的影响[J]. 临床麻醉学杂志，2012，6(28)：609-610.

[5]Longa EZ，Weinstein PR，Carlsons S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion with outcraniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20(1)：84-91.

[6]廖维靖，刘淑红，范明线，等. 线栓阻断大鼠大脑中动脉制作缺血性脑损伤模型的改良[J]. 中华物理医学与康复杂志，2002，24(6)：6345-6348.

[7]辛浩琳，郭 娜，徐忠信. MMP-2、MMP-9对脑缺血再灌注大鼠紧密连接蛋白影响的实验研究[J]. 医学理论与实践，2015，28(7)：841-843.

[8]Chen Q，Jim M，Yang F，et al. Matrix met all oprotehases：inflam matory regulators of cell behaviors in vascular formation and remodeling[J]. Mediators Inflamm，2013，2013：928315.

[9]Jin R，Song Z，Yu S，et al. Phosphatidylinositol-3-kinase 1 plays a central role in blood-brain barrier dysfunction in acute experimental stroke[J]. Stroke，2011，42：2033-2044.

[10]BarrTL，LatourLL，LeeKY，et al. Blood-brain barrier disruption in humans is independently associated with increased matrix metalloproteinase-9[J]. Stroke，2010，41：e123-e128.

[11]KangwantasK，PinteauxE，PennyJ. The extracellular matrix protein laminin-10 promotes blood-brain barrier repair after hypoxia and inflammation in vitro[J]. J Neuroinflammation，2016，13(1)：13-25.

[12]张微微，魏亚洲，周小英. 大鼠脑缺血/再灌注层粘连蛋白表达的实验研究[J]. 北京医学，2005，27(7)：408-410.

[13]Ogden AT，Mayer SA，Connolly ES，et al. Hyperosmolar agent in neurosurgical practive the evolving role of hypertonic saline[J]. Neurosurgery，2005，57(2)：207-215.

Effect of hypertonic sodium chloride hydroxyethyl starch 40 on expression of MMP-9 and Laminin after rats cerebral ischemia reperfusion injury

LIUXingfang，ZHANGXiumei，LAILijuan，etal.

(MasterGraduateStudent，GannanMedicalUniversity，Ganzhou341000，China)

Objective To observe the effect of Hypertonic Sodium Chloride Hydroxyethyl Starch 40 (HSH) on neurological evaluations，degree of encephaledema，cerebral infarction volume and expression of MMP-9 and Laminin in rat cerebral ischemia/reperfusion(I/R) injury model. Methods 48 male SD rats were randomly divided into shame，model，experimental 1 and 2 group. Rat focal cerebral I/R injury model should been accomplished，after 120 minutes，shame and model group were treated with physiological saline，experimental 1 and 2 group were treated with 4 ml/kg and 8 ml/kg HSH by vein injection. After 24 hours’ reperfusion，neurological evaluations，TTC staining and degree of encephaledema would be executed，the expression of MMP-9 and Laminin would be tested by western blotting. Results Compared to the shame group，model group’s cerebral neurological evaluations(P<0.001)，infarction volume(P<0.001) and expression of MMP-9(P<0.05) respectively increased with an obvious encephaledema，but Laminin decreased(P<0.05). Compared to model group，experimental 1 and 2 group’s neurological evaluations(P<0.001) and cerebral infarction volume(P<0.001) decreased with a catabatic degree of encephaledema；the expression of MMP-9 in experimental 1 group decreased(P<0.05) and Laminin increased(P<0.05)，but those of experimental 2 group had no obvious change. Conclusion HSH can significantly reduce neurological evaluations，cerebral infarction volume，degree of encephaledema and BBB’s permeability in rat cerebral I/R injury model. These findings indicated that MMP-9 and Laminin may be involved in the protective mechanisms of HSH against cerebral I/R injury. The dose of 4 ml/kg is better.

Cerebral ischemia reperfusion injury； Hypertonic sodium chloride hydroxyethyl starch 40； MMP-9； Laminin

1003-2754(2017)01-0009-04

2016-09-12；

2016-12-03

江西省教育厅科学技术研究项目(No. GJJ12548)；江西省自然科学基金项目(No. 20142BAB205020)；赣南医学院研究生创新专项资金项目(No. YC2015-S408) 作者单位：(1.赣南医学院研究生学院，江西 赣州 341000；2.赣南医学院本科生，江西 赣州 341000；3.赣南医学院生理学教研室，江西 赣州 341000；4.赣南医学院疼痛医学研究所，江西 赣州 341000；5.赣南医学院第一附属医院麻醉科，江西 赣州 341000)

单热爱，E-mail：shanreai@163.com

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