细胞核移植技术简介

于彦军

(新疆乌苏市第一中学 833000)

自1997年首次报道Wilmut以成年绵羊乳腺上皮细胞为核供体的克隆羊“Dolly”诞生以来，研究人员相继以牛、猪、猴、兔、鼠、山羊和猫等哺乳动物为研究对象，进行多种体细胞克隆的研究。目前，标准的细胞核移植方法包括3个基本步骤：卵母细胞去核、供体核 (或者细胞)植入、重构胚的激活。然后将克隆胚胎体外培养后移植入代孕母体。

1 卵母细胞的去核技术

建立一种损伤小、可重复性高、效率高的去核方法是核移植成功的重要保障。准确而快速地去除卵母细胞的核是实验的关键。目前，有多种去核方法成功应用于哺乳动物的核移植中。

1.1 盲吸法 将卵母细胞放在含一定浓度的细胞松弛素B(CB)显微操作液中，孵育一定时间后，固定住卵母细胞，吸出第一极体及其附近的适量胞质(约1/4～1/3)。缺点是由于该法去除的细胞质较多，降低了核移植后重构胚的发育能力。也有通过激活卵母细胞，再去除末期卵母细胞染色体的方法。

1.2 半卵法 在显微操作仪下，切开透明带，将吸出的一半细胞质送入另一个空透明带内，然后再用荧光染料Hoeehest33342染色，以确定哪一半胞质有核物质。在标准体细胞核移植中，透明带是保存的，因为透明带被认为在支持胚胎的发育中起重要作用。

1.3 功能性去核法 将受体卵母细胞放置在Hoeehest染液中，用激光或紫外线照射，使卵母细胞核丧失功能，从而实现去核目的。

1.4 蔗糖辅助去核法 在含一定浓度的蔗糖和一定浓度的CB显微操作液中，预处理卵母细胞10 min，待卵母细胞边缘有突起时，在此区上方将透明带切开1/4～1/5的周长，然后一并吸出突起部位以及附近的少量胞质和第一极体。蔗糖辅助去核法能确定卵母细胞减数分裂II期(MII)核的位置，可避免荧光染色的不利因素。但蔗糖的渗透压对卵母细胞形态发育有影响，通常很难达到较好的去核效果。

1.5 化学去核法 在卵母细胞减数分裂的过程中，添加化学诱导剂，以破坏纺锤体微管的功能，使得极体不与核染色体发生分离，极体与核染色体一起被排到卵周隙，以达到去核目的。例如，将卵母细胞依次移入含脱羰秋水仙碱(DC)和DC+放线菌酮(CHX)的KSOM 培养液中培养，直到第一极体排出。其整个去核过程不需显微操作仪。该方法易于操作、简单。但研究发现，在利用不同的化学诱导剂诱导去核后，胞质中重构胚发育的能力不同，且发育率较低，因而限制了该方法的广泛应用。

1.6 化学辅助去核法 在化学诱导法基础上对其进行改进，例如，用脱羰秋水仙碱处理排出第一极体的卵母细胞，使卵胞质中含染色体的部分形成一个胞质突起，用以确定核所在位置，然后通过显微操作，一并去除核及第一极体，达到去核目的，此法称为化学辅助去核法。由于该法化学诱导剂作用时间短，可减少对胞质的毒副作用，胞质去除量也少。

1.7 荧光染色去核法 将卵母细胞置于含CB(7.5mg/L)和Hoechest33342(5 mg/L)的FHM 中一定时间[1]。在紫外光下，卵母细胞的纺锤体呈淡紫色。先刺破透明带，挑出第一极体，再一并吸出纺锤体复合体及周围少量细胞质。去核完成后，再置于Hoechest33342(5 mg/L)的FHM 中，紫外光下鉴定去核的卵母细胞是否残留染色质以判定去核率。结合DNA 染色荧光检测技术，可以明确细胞核的位置，以确保高的去核率，但也产生紫外光照射的不利影响。

2 供体核 (或者细胞)植入的技术

2.1 “Honolulu”法 借助Piezo装置，向胞质内直接注射的方法称为“Honolulu”法。该方法是利用瞬间高电压，在卵母细胞的透明带上打出小孔，从而将供体细胞核直接注入去核的卵母细胞质中。该方法可降低对卵母细胞的机械损伤，提高操作效率，但需要昂贵的Piezo设备。

2.2 电融合法 动物细胞融合技术的出现，给核移植一个新的启示，随之产生了电融合法。电融合法是指把整个供核细胞注射到透明带和卵胞质膜之间，再利用一定强度的直流脉冲刺激，使供体细胞与去核卵母细胞融合，进而使供体核进入受体卵母细胞中。

2.3 去透明带法 2005年，Ribas等先用链蛋白酶或泰洛乳酸[1]去除卵母细胞透明带后，再去核，接着用植物血凝素做黏合剂，将去除透明带的卵母细胞和供体细胞粘在一起，再进行电融合。此方法经历去透明带、去核、黏合、融合4个步骤。其优点是无需昂贵的Piezo设备，同时减少了去核和注核过程中对卵母细胞的损伤。缺点：①增加了化学试剂对重构胚的损伤；②在融合时，卵胞质膜和电极直接接触，加大细胞损伤的可能性。

2.4 连续核移植法 连续核移植法是先将供体核移入第一受体细胞，再移入第二受体细胞。 通常以去核的MⅡ期卵母细胞为第一受体细胞， 以去核的单细胞胚胎为第二受体细胞。研究表明，连续核移植法可延长母系胞质因子和染色质间的接触时间，有利于促进核的重编程，从而利于提高核的发育潜力。但更多的体外操作很容易对胚胎造成亚细胞水平的伤害。

2.5 反向核移植法 反向核移植法是将供体细胞注入未去核的卵母细胞中，经适当处理让第二极体排出。用注核针再吸去第二极体及其附近的少量胞质。也就是说，反向核移植法就是先注核，待胚胎激活后再去核。多项研究表明，反向核移植法在提高核移植胚胎的存活率上较传统的核移植方法好[2]。

3 重构胚的激活技术

重构胚激活的终极目标是要使处于MⅡ期的卵母细胞恢复分裂周期[3]。MⅡ期的卵母细胞由于持续高水平的成熟促进因子(MPF)和细胞静止因子(CSF)的存在，导致其不能进入到末期。因此，卵母细胞中的MPF和CSF活性的下降或消失才能恢复分裂周期。自然受精过程中，胚的激活是在精子的穿透作用下，胞质中钙离子水平升高，从而导致MPF减少而实现的[2]。任何能够让胞质中钙离子水平增高的机制都可以激活重构胚，包括电激活、机械激活和化学激活。常用的激活方法是化学法、电脉冲法。

3.1 物理激活 在物理激活方法中，温度刺激和机械刺激因其操作繁琐，重复性和稳定性差，且孤雌激活率偏低而较少采用。反之，电刺激激活法因简便易行、重复性和稳定性较好，且将激活和融合成为一体而被广泛应用。电激活的原理是利用短暂高压的直流电脉冲使细胞膜出现穿孔，造成细胞内外的离子和大分子发生短暂流动，引起Ca2+内流，使细胞内Ca2+脉冲升高而激活细胞[4]。

3.2 化学激活 近年来，人们开始用结果较稳定、重复性高的化学激活方法来激活卵母细胞。在大多数哺乳动物中，排出的卵母细胞都停留在MⅡ期不再分裂。卵母细胞直至被精子受精激活或人工诱导激活，才完成第二次分裂。常用乙醇、离子霉素(Ion)、CHX和二甲氨基嘌呤(6-DMAP)等中的一种或若干种联合激活：①乙醇对卵母细胞的激活。乙醇是发现较早的一种化学激活剂，乙醇能水解细胞膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇，产生1，4，5-三磷酸肌醇，从而使细胞内源钙释放到细胞质，造成胞内的钙离子浓度升高。②Ion是近年来发现的一种高效Ca2+载体，已在哺乳动物卵母细胞的激活中广泛应用。Ion并不直接造成Ca2+的跨膜转运，而是动员细胞内的Ca2+，依次触发Ca2+的内流，导致细胞内Ca2+升高，从而激活卵母细胞。③6-DAMP和CHX对卵母细胞的激活。6-DMAP是一种蛋白质磷酸化抑制剂，它既能阻止蛋白质磷酸化，又能抑制CSF和MPF的活性。CHX是一种蛋白质合成抑制剂，主要抑制维持卵母细胞在MⅡ期所需的CSF和MPF的合成，从而使卵母细胞中MPF活性迅速降低而脱离MⅡ期，完成减数第二次分裂。

3.3 联合激活 通常采用的联合激活法有以下几种：①电激活+6-DMAP，实验表明该种激活方法具有更多的细胞数和更高的囊胚形成率，电激活后用5 mmol/L的6-DMAP作用3 h，有34.3%的孤雌激活卵细胞发育到囊胚期；②电激活+CHX，电激活后用CHX处理可使激活率达97%，有90.6%的激活胚胎形成了核[3]；③电激活+ CB+6-DMAP，对牛的实验表明，电激活+CB+6-DMAP联合激活下卵裂率、囊胚率和融合率最高，对重构胚的发育十分有效[5]。