LPS对肝癌细胞TLR4及IL-23/IL17A表达的影响

康玉明，苏国爱，张艳丽

·论 著·

LPS对肝癌细胞TLR4及IL-23/IL17A表达的影响

康玉明1，苏国爱2，张艳丽3

目的 观察Toll样受体4(TLR4)的激动剂LPS (LPS)对肝癌HepG2细胞株表达 TLR4、IL-23/IL-17A的影响，探讨TLR4、IL-23/IL-17A在肝癌发生中的作用及可能机制。方法 用LPS 1 mol/L作用HepG2细胞24 h，或先用LPS作用HepG2细胞24 h后再用髓样分化因子-88(MyD88)的阻断剂ST2825作用HepG2细胞8 h，运用Q-PCR法检测TLR4、IL-23、IL-17A在HepG2细胞的转录水平；应用Western-blot方法测定TLR4、IL-23及IL-17A在HepG2细胞的表达，采用ELISA法检测HepG2细胞培养上清液中IL-23在12 h、24 h、36 h的分泌水平。结果 LPS可促进HepG2细胞株IL-23的分泌和TLR4、IL-23、IL-17A mRNA的转录及蛋白表达，阻断MyD88后其表达水平比LPS组明显降低，趋于正常组水平。结论 TLR4、IL-23及IL-17A参与原发性肝癌的发生与进展。

肝癌，Toll样受体；白介素-23；白介素质-17A

肝细胞癌(HCC)是全球常见恶性肿瘤，也是最难治疗的癌症之一[1]。炎症与肿瘤的发生和发展密切相关。研究表明，Toll样受体4(TLR4)高表达与乳腺癌、肺癌、前列腺癌、直肠癌和肝癌[2]的发生与进展有密切关系。TLR4和骨髓分化因子(MyD88)已被证明在炎症反应发挥重要作用，TLR4识别LPS并与其结合后，可激活TLR4信号转导通路，其中MyD88作为TLR4的链接蛋白继而活化NF-κB转录并产生相关促炎细胞因子。有报道称IL-23/IL-17 轴在肿瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病中起重要作用[3-5]，但TLR4活化与IL-23/IL-17在导致肿瘤发生和进展所处的炎症环境中的具体分子机制尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 细胞：肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞HL-7702均由本校生化实验室杨怡教授馈赠。

1.2 主要试剂与仪器:LPS购自美国Sigma公司，ST2825为Med Chem Express公司产品；引物序列由上海生工科技有限公司合成；TLR4、IL-23及IL-17A单克隆抗体购自英国Abcam公司；RPMI 1640培养基购自Hyclone公司，DMEM培养基为GBICO公司产品；TRIZOL总RNA提取液为美国Invitrogen公司产品，逆转录试剂盒为Promega公司产品；SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；β-actin为北京中衫金桥有限公司产品；Nanodrop2000由美国Thermo公司制造，ABI-7300 型Real-time PCR 检测仪购自美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养：细胞常规复苏后，肝癌细胞株HepG2用DMEM(含10%胎牛血清)培养液、人正常肝细胞系细胞系HL-7702用RPMI1640完全培养液重悬细胞后移入培养瓶于37℃、5% CO2的培养箱中培养，逐日观察，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3.2 引物设计与合成：由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，经验证后使用。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.3.3 Q-PCR法测定TLR4、IL-23及IL-17A mRNA的转录水平:生长旺盛状态的人肝癌细胞HepG2置于6孔板培养，按分组条件加样并培养。实验分为3组：第1组为正常对照组，第2组加LPS 1 mol/L培养24 h，第3组先加 LPS 1 mg/L培养24 h，之后加ST2825 40 μmol/L培养8 h)。严格按试剂盒说明提取细胞(细胞计数约为106个)总RNA并测定其浓度和纯度，采用美国Promega公司逆转录试剂盒进行反转录合成cDNA。PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；PCR循环(×40循环)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(Data collection)，熔解曲线分析(Melting Curve Analysis)。待PCR反应结束后，目的基因扩增产物的相对含量用2-ΔΔCt法计算，试验重复3次。

1.3.4 Western blot法检测TLR4、IL-23及IL-17A的表达:取对数生长期的HepG2细胞培养于6孔板，实验处理条件及分组同1.3.3。提取细胞总蛋白(细胞计数约为106个)，调节样品蛋白浓度为10 μg/L。取10 μl蛋白样品行SDS-PAGE电泳，在60 V、300 mA、4 ℃恒流条件下转膜3 h，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜；TBST洗3次，TLR4、IL-23、IL17A和β-actin抗体用5%脱脂奶粉PBS溶液1∶1 000稀释，37 ℃孵育3 h。TBST洗3次后加1∶2 000的羊抗兔二抗，37 ℃孵育2 h后用TBST 洗涤，DAB显色，ECL发光及曝光，胶片拍照。

1.3.5 ELISA试剂盒检测IL-23的水平:培养HepG2细胞于96孔板，5 000个细胞/孔，按实验分组并处理HepG2细胞，继续分别培养12 h、24 h和36 h并收集细胞上清液。严格按照ELISA试剂盒操作流程检测IL-23的分泌水平，酶标仪波长测OD值，根据标准曲线绘制图。

2 结果

2.1 LPS促进TLR4、IL-23 及IL-17A mRNA的转录:HepG2细胞用LPS或ST2825处理后，采用Q-PCR法测定TLR4、IL-23、IL-17AmRNA的转录水平，。经LPS 1 mg/L 培养24 h的HepG2细胞与正常肝细胞HL-7702比较，差异有统计学意义(P<0.05)；在HepG2细胞，LPS组与对照组比较，TLR4 mRNA相对表达量提高(P<0.05)，ST2825组与LPS组比较，TLR4mRNA的表达无明显变化。在HepG2细胞LPS组的IL-23、IL-17A的 mRNA转录水平明显高于HL-7702细胞的(P<0.05)；LPS组与对照组比较，IL-23、IL-17A的 mRNA相对表达量明显提高(P<0.05)；而ST2825组相对于LPS组的IL-23、IL-17A的 mRNA表达则明显降低(P<0.05)。

2.2 LPS促进TLR4 、IL-23 及IL-17A 在肝癌细胞的蛋白表达:Western-blot法观察在HepG2细胞株TLR4、IL-23、IL-17A蛋白的表达，经灰度扫描分析，以HepG2细胞TLR4、IL-23、IL-17A条带灰度值除以相应的β-actin条带灰度值作为HepG2细胞 TLR4、IL-23、IL-17A蛋白的相对表达量。结果显示LPS促进HepG2细胞株TLR4、IL-23、IL-17A的蛋白表达(P<0.05)，阻断MyD88后IL-23和IL-17A蛋白表达则明显降低(P<0.05)。

2.3 LPS促进HepG2细胞培养上清IL-23的分泌水平:ELISA结果表明，HepG2细胞的上清液IL-23在不同时间内LPS组间差异有统计学意义(P<0.05)，而在同一时间内LPS处理组与对照组比较IL-23的表达升高(P<0.05)，ST2825组与LPS组比较，IL-23的表达明显下降(P<0.05)，见表2。

表2 ELISA法检测HepG2细胞中IL-23的表达量

注：*与对照组比较,P<0.05；#与ST2825组比较,P<0.05。

3 讨论

肝脏的慢性炎症是公认的致癌危险因素[6]，TLR4识别并结合后，可激活依赖MyD88的信号转导通路，促进丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和IκB激酶家族(IKKs)磷酸化，最终分别活化转录因子激活蛋白-1(AP-1)和NF-κB，促进炎性反应因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6和IL-1等的分泌，引发炎性反应。本研究发现LPS刺激肝癌细胞株HepG2后，TLR4的表达在基因与蛋白水平明显提高，且在翻译与转录的水平保持一致，而经ST2825预处理后再加入LPS则TLR4表达无明显变化，提示肝癌细胞表面TLR4可以通过与其外源性配体LPS结合，活化依赖MyD88的TLR4信号传导通路，诱导众多炎症相关的特异基因的表达，从而使细胞分泌许多相关的炎症细胞因子，营造出有利于肿瘤生长的炎症微环境。

IL-23是IL-12家族成员之一，通过TLR4刺激DC和巨噬细胞诱导产生IL-23。许多研究显示诱导IL-23刺激Th细胞激活产生IL-17A，MyD88信号在CD4+T细胞缺乏损害了Th17细胞分化和IL-23信号，说明IL-17A和IL-23信号途径依赖MyD88[7]。坏死肝细胞释放高迁移率族蛋白1(HMGB1)刺激肝巨噬细胞产生IL-23其依赖TLR-4信号途径，IL-23帮助肝脏的γδ T细胞产生IL-17A。因此，TLR4通过上调巨噬细胞和γδT细胞的IL-23/17A轴从而促进中性粒细胞聚集，加重肝脏的炎症[8]。本研究发现，TLR4的外源性配体LPS可活化诱导肝癌HepG2细胞表达IL-23和IL-17A，其结果在基因和蛋白表达水平一致。阻断MyD88，与较单独LPS刺激HepG2细胞相比，IL-23和IL-17A的基因和蛋白表达明显下降。说明LPS-TLR4通路促进了肝癌HepG2细胞IL-23和IL-17A细胞因子的产生，参与或加重了肝癌炎症微环境的形成，从而促进肝癌细胞的生存、增殖和进展。

本研究结果说明，TLR4介导的信号转导通路可调控IL-23/IL-17A炎症轴，为肝癌的临床免疫治疗提供了一个有前途的干预策略，但调控的具体分子机制尚需本实验室后续更为详尽的研究。

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Effect of LPS on the expression of TLR4，IL-23 and IL-17A in HepG2 cell line

KANGYuming1，SUGuoai2，ZHANGYanli3.

1.DepartmentofHepatobiliarySurgery，GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China;2.BeijingRenheHospital，Beijing102600，China;3.LaboratoryofImmunology，BasicMedicineCollegeofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China

Correspondingauthor:ZHANGYanli,Email:wi_ntersweet@126.com

Objective To explore the effect of TLR4 agonist lipopolysaccharides (LPS)on the expression of interleukin -23 (IL-23)and IL-17A in HepG2 cell line，to analyze the mechanism of TLR4，IL-23 and IL-17A in carcinogenesis of hepatocellular carcinoma.Methods HepG2 cells were stimulated with LPS 24h，then treated HepG2 cells 8h with Myeloid differentiation factor 88 (MyD88)and inhibitors ST2825.The mRNA level of TLR4，IL-23 and IL-17A in HepG2 cells was detected by Q-PCR.The expression of TLR4，IL-23 and IL-17A was measured by Western-blot；The level of IL-23 was measured by ELISA at 12 h，24 h and 36 h.Results LPS promoted mRNA transcription level of TLR4，IL-23 and IL-17A in HepG2 cell lines and the protein expression of TLR4，IL-23，IL-17A，while ST2825 inhibited the expression of TLR4，IL-23，IL-17A.LPS enhanced the secreted level of IL-23 in different time-phase.Conclusion TLR4，IL-23 and IL-17A are involved in the occurrence and progress of hepatocellular carcinoma.

Hepatocellularcarcinoma；TLR4；IL-23；IL-17A

10.13621/j.1001-5949.2017.01.0006

宁夏自然科学基金资助项目(NZ14139)

1.宁夏医科大学总医院肝胆外科，宁夏 银川 750004 2.北京仁和医院，北京 102600 3.宁夏医科大学基础医学院，宁夏 银川 750004

康玉明(1972-)，男，学士学位，主任医师，从事肝胆外科专业。

张艳丽，Email:wi_ntersweet@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170112.1708.022.html

R735.7

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2016-08-17 [责任编辑]马兴忠