自发性高血压大鼠外周血淋巴细胞连接蛋白43与炎性因子表达水平的相关性研究

王 爱，潘立君，于秀石，李 丽，司军强，马克涛*，李新芝

·论著·

自发性高血压大鼠外周血淋巴细胞连接蛋白43与炎性因子表达水平的相关性研究

王 爱1，2，潘立君3，于秀石1，2，李 丽1，2，司军强1，2，马克涛1，2*，李新芝1，4

高血压；连接蛋白43；炎症；淋巴细胞

王爱，潘立君，于秀石，等.自发性高血压大鼠外周血淋巴细胞连接蛋白43与炎性因子表达水平的相关性研究[J].中国全科医学，2017，20(2)：177-181.[www.chinagp.net]

WANG A,PAN L J, YU X S,et al.Correlation between connexin 43 in peripheral blood lymphocytes and expression level of inflammatory factors among spontaneously hypertensive rats[J].Chinese General Practice，2017，20(2)：177-181.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 于2015年4月—2016年4月，选取自发性高血压(SH)大鼠和正常血压的Wistar京都(WKY)大鼠各20只，16～18周龄，雄性，体质量150～220 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证编号SCXK京2007-0001)，已达到清洁级标准，动物质量为一级标准。饲养环境要求：良好通风、空气过滤系统，环境安静，室温保持20 ℃、湿度控制在45%左右，每日更换垫料和饮用水，自由摄取水和食物。

1.1.2 仪器及试剂 流式细胞仪(E6)购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，水浴锅(H216)购自上海博讯实业有限公司，低速大容量离心机(LC-4016)购自安徽中科中佳科学仪器有限公司，相差倒置显微镜(XD30)购自宁波舜宇仪器有限公司，生物安全柜(BHC-1300ⅡA2)购自阿尔泰实验室设备(北京)有限公司，CO2恒温培养箱(HF151)购自上海力申科学仪器有限公司，凝胶成像仪(BioDoc Imaging)购自美国UVP公司，梯度PCR仪〔TC-96/G/H(b)C〕购自杭州博日科技有限公司，酶标仪、微量分光光度计(K5500)购自北京凯奥科技发展有限公司，荧光定量PCR仪(TIB-8000)购自泰普生物科学(中国)有限公司。

别藻青蛋白(allophycocyanin，APC)标记小鼠抗大鼠CD4抗体(B159112)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记小鼠抗大鼠CD8a抗体(B166485)、PE标记IgG1、кIsotype Ctrl同型对照(B179044)均购自Bio Legend公司，小鼠来源抗大鼠Anti-Cx43(ab-79010)购自Abcam公司，山羊抗小鼠IgG/异硫氰酸荧光素(FITC)标记二抗(ZF-0312)购自北京中杉金桥生物科技有限公司，大鼠白介素(IL)-2(230240922)、IL-6(230641023)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自杭州联科生物技术股份有限公司，淋巴细胞分离液(LTS10770125)购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，RPMI 1640培养基(1279443)购自美国Gibco公司，Concanavalin A(C-2010)购自美国Sigma公司，缝隙连接阻断剂Gap27(A1045)购自Apexbio公司，实时荧光定量PCR试剂购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司，Trizol购自life technologies公司，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠血压测定 应用BP-6无创血压监测仪测量大鼠尾动脉血压，避免大鼠躁动，于大鼠清醒安静状态下连续测量3次，每次间隔至少1 min，测量3次取平均值即为大鼠收缩压。

1.2.2 样本采集 3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集腹主动脉外周血5 ml，1 500 r/min离心5 min(离心半径20 cm)，取血浆于-20 ℃保存，离心后的下层血细胞用于分离外周血淋巴细胞。

1.2.3 炎性因子IL-2和IL-6表达 取冻存于-20 ℃的血浆样品，ELISA法检测IL-2和IL-6表达水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 淋巴细胞分离 将血细胞与0.9%氯化钠溶液1∶1等体积稀释，吹打混匀。取无菌15 ml离心管，加入淋巴细胞分离液，将淋巴细胞悬液缓慢按照1∶1比例加到淋巴细胞分离液上层，保证血液置于淋巴细胞分离液上层。根据密度梯度离心法分离淋巴细胞，低速离心机水平离心30 min(1 500 r/min，缓升缓降，离心半径20 cm)。将分离的白色浑浊淋巴细胞层吸出至无菌15 ml离心管内，加入3倍体积0.9%氯化钠溶液洗涤，以1 800 r/min离心6 min(离心半径20 cm)。洗涤2次，弃上清液，沉淀即淋巴细胞。加入1 ml培养基重悬，吸取50 μl到1.5 ml离心管，加450 μl磷酸盐缓冲液(PBS)稀释10倍，显微镜下计数并用锥虫蓝染色观察淋巴细胞活性。淋巴细胞活性为95%以上，调整淋巴细胞浓度为1×106个/ml，将淋巴细胞接种在24孔板中。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测IL-2 mRNA和IL-6 mRNA表达 计数分离出的淋巴细胞，调整培养基至淋巴细胞浓度为1×106个/ml。将淋巴细胞分为空白对照组、刀豆蛋白A(Concanavalin A，ConA)组(培养48 h后加入5 μg/ml ConA)和Gap27+ConA组(培养前加入500 μmol/L Gap27，培养48 h后加入5 μg/ml ConA)。加入10%自体血清(血清处理步骤：56 ℃灭活30 min，以4 000 r/min离心30 min，离心半径20 cm，4 ℃保存)，于37 ℃，5% CO2培养箱中培养48 h。

Trizol法提取上述培养的淋巴细胞mRNA，核酸蛋白含量检测仪测定A260/A280值，1%甲醛溶液变性凝胶电泳检测提取淋巴细胞mRNA的质量。选用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参基因，GAPDH引物序列：上游：5′-CTCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3′,下游：5′-GCCAAATCCGTTCACACCG-3′；IL-2引物序列：上游：5′-ACGCTTGTCCTCGCTA-3′，下游：5′-GCACCTGTAAGTCCAGCAAC-3′； IL-6引物序列：上游：5′-TTGGGACTGATGTTGTTGAC-3′，下游：5′-TGTGGGTGGTATCCTCTGT-3′。将提取的mRNA样品、随机引物、Rtmix、dNTP混合液、焦碳酸二乙酯(DEPC)按照反转录体系配制反应体系，按照37 ℃反转录60 min，90 ℃灭活反转录酶5 min的反应程序进行反转录合成cDNA。将2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix，10×miScript Nucleics Mix通用引物，模板cDNA和RNase-Free water置于冰上，并轻轻混匀，配制反应体系，按照95 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸10 s，40个循环设置Bio-Rad荧光定量PCR仪，记录IL-2 mRNA与IL-6 mRNA相对表达水平。

2 结果

2.1SH和WKY大鼠收缩压比较SH大鼠收缩压为(211±15)mmHg(1mmHg=0.133kPa)，高于WKY大鼠的(122±5)mmHg，差异有统计学意义(t=25.22,P<0.01)。

2.2SH和WKY大鼠炎性因子表达水平比较SH大鼠IL-2表达水平为(152.40±29.62)pg/ml，高于WKY大鼠的(73.41±20.16)pg/ml，差异有统计学意义(t=7.24，P<0.05)；SH大鼠IL-6表达水平为(29.74±1.90)pg/ml，高于WKY大鼠的(22.58±1.06)pg/ml，差异有统计学意义(t=14.72，P<0.05)。

2.4 各组淋巴细胞IL-2mRNA、IL-6mRNA相对表达水平比较SH大鼠各组淋巴细胞IL-2mRNA、IL-6mRNA表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05),其中ConA组IL-2mRNA、IL-6mRNA表达水平均高于空白对照组和Gap27+ConA组，Gap27+ConA组IL-6mRNA表达水平低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。WKY大鼠各组淋巴细胞IL-6mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。WKY大鼠各组淋巴细胞IL-2mRNA表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05),其中ConA组IL-2mRNA表达水平高于空白对照组和Gap27+ConA组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

Table 1 Comparison of the expression levels of IL-2 and IL-6 mRNA among different groups of SH rats and WKY rats

组别SH大鼠IL⁃2mRNA IL⁃6mRNAWKY大鼠IL⁃2mRNA IL⁃6mRNA空白对照组240±008231±001107±021109±004ConA组621±046a281±008a355±038a135±024Gap27+ConA组176±045b134±024ab133±024b130±005F值409462692291092P值<001<001<001044

注：SH=自发性高血压，WKY大鼠=Wistar京都大鼠，IL-2=白介素2，IL-6=白介素6，ConA=刀豆蛋白A；与空白对照组比较，aP<0.05；与ConA组比较，bP<0.05

3 讨论

WAKI等[8]研究发现，高血压模型动物脑干中细胞因子表达上调，炎性细胞可影响其血压的调节。血管紧张素Ⅱ可刺激大鼠神经中枢，活化T淋巴细胞，加重高血压进展[9]。炎性因子主要由免疫细胞释放，参与调节机体免疫反应，在细胞增殖、分化、免疫修复等过程中发挥主要作用[10]。MADHUR等[11]研究表明，原发性高血压病患者血清C反应蛋白、肿瘤坏死因子α和IL-6等炎性因子水平与血压升高呈正相关。本实验结果显示，SH大鼠炎性因子IL-2和IL-6表达水平均高于WKY大鼠，与既往研究[12]一致，提示SH与炎性反应关系密切。

Gap27作为特异性缝隙连接阻断剂，可能作用于Cx细胞膜第二胞外环，阻断三磷腺苷(ATP)释放和钙离子内流，发挥阻断作用[17]。OVIEDO-ORTA等[18]研究发现，缝隙连接参与调节淋巴细胞与巨噬细胞间信号传递，并且在炎性因子刺激下，单核细胞Cx43表达上调[4]。本研究发现，Gap27可使T淋巴细胞炎性因子IL-2 mRNA和IL-6 mRNA表达下调。NIGER等[19]研究发现，缝隙连接影响炎性因子和免疫球蛋白的分泌，本研究结果与其相符，提示缝隙连接阻断剂可能通过改变Cx43通道结构或抑制细胞内钙离子浓度进而改变通道通透性[20]，从而影响炎性因子的释放。

综上所述，SH大鼠伴随炎性反应，炎性因子释放增加，同时构成T淋巴细胞间缝隙连接通道的Cx43表达显著上调，应用缝隙连接阻断剂阻断T淋巴细胞间信息通讯后炎性因子的释放显著下降，提示缝隙连接参与高血压炎性反应，具体机制有待进一步研究。

作者贡献：王爱、李丽、司军强、马克涛进行课题设计与实施、资料收集整理、成文并对文章负责；潘立君、于秀石、李新芝进行课题设计与实施、评估、资料收集整理；马克涛进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

[1]ARIMA H,MURAKAMI Y,LAM T H,et al.Effects of prehypertension and hypertension subtype on cardiovascular disease in the Asia-Pacific Region[J].Hypertension,2012,59(6)：1118-1123.

[2]SCHECKENBACH K E,CRESPIN S,KWAK B R,et al.Connexin channel-dependent signaling pathways in inflammation [J].J Vasc Res,2011,48(2)：91-103.

[3]TITTARELLI A,MENDOZA-NARANJO A,FARAS M,et al.Gap junction intercellular communication regulate NK cell activation and modulate NK cytotoxic capacity[J].J Immunol,2014,192(3)：1313-1319.

[4]MATSUE H,YAO J,MATSUE K,et al.Gap junction-mediated intercellular communication between dendritic cells(DCs) is required for effective activation of DCs[J].J Immunol,2006,176(1)：181-190.

[5]GLASS A M,SNYDER E G,TAFFET S M.Connexins and pannexins in the immune system and lymphatic organs[J].Cell Mol Life Sci,2015,72(15)：2899-2910.

[8]WAKI H,GOURAUD S S,MAEDA M,et al.Evidence of specific inflammatory condition in nucleus tractus solitarii of spontaneously hypertensive rats[J].Exp Physiol,2010,95(5)：595-600.

[9]MARVAR P J,HARRISON D G.Stress-dependent hypertension and the role of T lymphocytes[J].Exp Physiol,2012,97(11)：1161-1167.

[10]SAADOUN D,GARRIDO M,COMARMOND C,et al.Th1 and Th17 cytokines drive inflammation in Takayasu arteritis[J].Arthitis Rheumatol,2015,67(5)：1353-1360.

[11]MADHUR M S,HARRISON D G.Synapses,signals,CDs,and cytokines：interactions of the autonomic nervous system and immunity in hypertension[J].Circ Res,2012,111(9)：1113-1116.

[12]YU H T,PARK S,SHIN E C,et al.T cell senescence and cariovascular diseases[J].Clin Exp Med,2016,16(3)：257-263.

[13]TAKEUCHI H,SUZUMURA A.Gap junction and hemichannels composed of connexins：potential therapeutic targets for neurodegenerative diseases[J].Front Cell Neurosci,2014,8：189.

[14]PONCE A,LARRE I,CASTILLO A,et al.Ouabain increases gap junctional communication in epithelial cells[J].Cell Physiol Biochem,2014,34(6)：2081-2090.

[15]RAJNAI H,TELEKI L,KISZNER G,et al.Connexin 43 communication channels in follicular dendritic cell development and in follicular lymphomas[J].J Immunol Res,2015,2015：528098.

[16]KUCZMA M,LEE J R,KRAJ P.Connexin 43 signaling enhances the generation of Foxp3+regulatoty T cells[J].J Immunol,2011,187(1)：248-257.

[17]CHEN G,PARK C K,XIE R G,et al.Connexin-43 induces chemokine release from spinal cord astrocytes to maintain late-phase neuropathic pain in mice[J].Brain,2014,137(Pt 8)：2193-2209.

[19]NIGER C,HOWELL F D,STAINS J P.Interleukin-1 beta increases gap junctional communication among synovial fibroblasts via extracellular-signal-regulated kinase pathway[J].Biol Cell,2009,102(1)：37-49.

[20]MENDOZA-NARANJO A,SAÉZ P J,JOHANSSON C C,et al.Functional gap junctions facilitate melanoma antigen transfer and cross-presentation between human dendritic cells[J].J Immunol,2007,178(11)：6949-6957.

本文链接：

——连接蛋白43

细胞连接通讯是动物体内细胞通讯的主要方式之一，其发挥细胞之间信息传递功能的结构基础是细胞间隙连接，而细胞间隙连接的主要结构成分是连接蛋白。对于细胞间信息传递、细胞的生长、分化、维持心肌节律性同步收缩具有重要的意义。连接蛋白家族是一组高度相关的蛋白质家族，每一个蛋白均是一种基因的产物。目前已发现十几种连接蛋白，其中连接蛋白43是由总跨度为2768碱基对的三条互补脱氧核苷酸所编码的含有387氨基酸的单肽。连接蛋白43在维持正常心律的电生理中起重要作用，连接蛋白43是主要的间隙连接蛋白也是心室肌细胞主要连接蛋白。连接蛋白43与心律失常、分娩、肿瘤等的发生密切相关，随着研究的进一步深入，从分子水平、基因转录等着手，更进一步阐述其致病机制，可能为临床的诊断和治疗提供新的理论依据。

(本文编辑：吴立波)

Correlation between Connexin 43 in Peripheral Blood Lymphocytes and Expression Level of Inflammatory Factors among Spontaneously Hypertensive Rats

WANGAi1，2,PANLi-jun3,YUXiu-shi1，2,LILi1，2，SIJun-qiang1，2,MAKe-tao1，2*,LIXin-zhi1，4

1.KeyLaboratoryforXinjiangEndemicandEthnicDiseasesoftheEducationMinistryofChina,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China2.DepartmentofPhysiology，MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China3.UrumqiPetrochemicalCompanyofChinaWorkerHospital，Urumqi830019，China4.DepartmentofPhysiologyandPathology,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832002,China

*Correspondingauthor：MAKe-tao，Professor;E-mail：maketao@hotmail.com

Hypertension； Connexin 43； Inflammation； Lymphocytes

国家自然科学基金资助项目(31260247，81460098，81560081,81660271)；石河子大学杰出青年人才培育计划项目(2012ZRKXJQ01)；石河子大学高层次人才科研启动计划(RCZX201449)

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.02.011

2016-03-08；

2016-10-09)

1.832002新疆石河子市，石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室

2.832002新疆石河子市，石河子大学医学院生理学教研室

3.830019新疆乌鲁木齐市，中国石油乌鲁木齐石化公司职工医院

4.832002新疆石河子市，石河子大学医学院病理生理学教研室

*通信作者：马克涛，教授；E-mail：maketao@hotmail.com