江苏省河蟹主养区微孢子感染情况调查报告

赵彦华，刘洪岩，丁正峰，孙梦玲，薛晖

（江苏省淡水水产研究所，江苏南京 210017）

江苏省河蟹主养区微孢子感染情况调查报告

赵彦华，刘洪岩，丁正峰，孙梦玲，薛晖

（江苏省淡水水产研究所，江苏南京 210017）

2015年7月江苏省兴化及周边盐城地区河蟹养殖大范围爆发河蟹肝胰腺坏死病，经调查研究确认为微孢子虫感染。采用PCR的方法对江苏省河蟹主要养殖区养殖塘口进行抽样调查，对所采集的河蟹标本进行微孢子虫感染情况调查。结果表明：抽样的八个河蟹主要养殖区，均有微孢子虫感染情况，其中以兴化和盐城的河蟹微孢子虫感染情况最为严重。

河蟹；感染；微孢子虫；调查报告

河蟹学名为中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），肉味鲜美，营养丰富，是我国名贵的淡水养殖品种之一。同时河蟹也是蟹类养殖中病害最为严重的一种，每年4—10月均有发病，7—9月是发病的高峰季节[1]。

微孢子虫（Microsporidian）作为一种真核生物专门寄生于细胞中，是一类古老的细胞内寄生物。宿主范围比较广泛，能够感染人类、水生甲壳类以及昆虫等多种生物。自1857年Nageli首次发现家蚕微粒子病病原生物Nosema bombycis后,人们对其进行了大量研究，特别是近年来，免疫缺陷患者体内微孢子虫的发现，更加引起了生物学界和医学界的广泛关注[2]。微孢子虫种类繁多，在显微镜下观察包囊形状也各异，如球形、纺锤形和椭圆形，其中以球形较为常见[3]。国内对于水生动物微孢子虫的研究较少，主要集中在家蚕的微孢子虫的研究上。然而，近些年来在水产养殖中频发微孢子虫病，严重威胁着一些经济水产动物的养殖[4]。

河蟹的养殖从20世纪80年代以来飞速发展，进入21世纪后，其产业得到了迅猛的发展[5]。江苏作为河蟹的主要养殖区，年产值可达到200亿，成为支撑江苏水产养殖的重要支柱。河蟹一旦感染疾病，在发病初期症状较轻，甚至不表现出明显症状，一旦蟹病大规模流行，就较难控制[6]。然而自2015年入夏后，兴化和盐城等地出现大批量养殖河蟹死亡的情况，主要表现为活力下降，不进食，开蟹盖后可见内脏及肝胰腺发白、坏死等情况，也就是养殖户俗称的“水瘪子”病，经研究表明为微孢子虫感染所致。因而本调查采用丁正峰等[7]建立的河蟹微孢子虫PCR检测方法对江苏省其他河蟹主要养殖区微孢子虫感染情况进行抽样调查。

1 材料及方法

1.1 样本采集

本次调查研究样品采集时间为2015年7—11月，采集地点是江苏省南京、常州、苏州、泰兴、无锡、盐城、扬州、镇江等地的河蟹养殖塘口，每个地方挑选2~4个不同的养殖户，每个养殖户采集河蟹30只，规格大约50 g每只，具体样本采集情况见表1。江苏省河蟹养殖方式主要为精养模式，塘口养殖前采用生石灰泼洒消毒，放苗时间一般为2月下旬，放养的蟹种规格比较齐全，体质强壮，活动性强，无明显可见病害。所有样品采集时均活力旺盛，采集后采用不同容器分装，采集当天带回实验室进行处理，处理时所采集样本均处于存活状态。

表1 微孢子虫普查地区分布情况表

1.2 样本处理

样本实验室处理时，分别标注采集地点和养殖户，分离河蟹肝胰脏用于实验研究，部分河蟹开壳后可见明显肝胰腺有发白现象，取样时方法严谨，防止不必要的交叉感染。

1.3 检测方法

根据需要配制实验所需裂解液（100 mmol/L NaCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0，25 mmol/L EDTA，pH值8.0，2%SDS，0.5%N-laurylsar-cosine；0.5 mg/mL蛋白酶K）；然后取河蟹肝胰脏100 mg于离心管中，使其破碎，加1 m L裂解液，混合均匀后65℃水浴1 h，加入5 mol/LNaCl，使得NaCl最终浓度为0.7 mol/L，缓慢加入10%体积的CTAB/Na－Cl，混匀后65℃水浴10min，加入等体积的氯仿/异戊醇，混均抽提，无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，干燥后DNA即可溶于0.1×TE缓冲液中，放于4℃贮存。

实验室检测采用的PCR检测方法：上游引物为MF1：5'-CCGGAGAGGGAGCCTGAGA-3'，下游引物为MR1：5'-GACGGGCGGTGTGTACAAA-3'，以被测样本DNA为模板，以MF1/MR1为正向和反向引物，进行片段扩增，PCR反应体系为引物MF1（10mM）0.5μL，引物MF2（10mM）0.5μL，EX 10X Buffer2μL，dNTPs（2.5 mM）2μL，EX Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.2μL，模板DNA1μL，去离子水13.8 μL，总体积为20μL。反应条件为：95℃变性4 min；接着35个循环的95℃1 min，58℃30 s，72℃1min；最后是72℃延伸5min，4℃保存。

PCR反应结束后，取10μL反应产物，以DNA Ladder作为分子量标准在1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统拍照观察，当阴性对照无条带，阳性对照和样品均在931 bp大小处出现条带，即可判定为阳性。

2 结果与分析

调查结果显示，江苏省河蟹主要养殖区微孢子虫感染普遍存在，在普查的13个县（市、区）共33个养殖户中，共抽取中华绒螯蟹990只，其中有449只感染微孢子虫，阳性率达到45%，其中兴化的感染率最高达到77%，其次为盐城感染率达到68%，具体感染情况见表2。

微孢子虫普查地区具体地理位置如图1所示，采集位置分别为南京、常州、苏州、无锡、泰州、盐城、扬州及镇江，河蟹的主要养殖区集中在江苏省苏南地区，并且各个地区均查出微孢子虫感染，尤其以盐城和泰州的感染较为严重。

3 小结

从本次调查报告可以看出，在江苏省河蟹的主要养殖区，均有微孢子虫感染情况存在，尤其是兴化市和盐城市，微孢子虫感染率较高，这也和2015年河蟹“水瘪子”病发病呈现正相关性。河蟹微孢子虫大范围感染，部分专家认为可能与近年来大规模养殖，水质污染严重有关。个别养殖户为了私人利益，违背繁殖规律，早育早繁，导致蟹苗的抗病力差，成活率低[8]。河蟹养殖密度过高必然会导致投饵量、蟹体的排泄物及水中的有机质增加，从而也为微孢子虫的传播创造了条件[9]。同时，由于养殖密度的加大，养殖水体内源性污染加重，病原微生物大量滋生，养殖环境呈现恶化趋势[10]。养殖环境的变化以及河蟹本身抵抗力的下降造成病害大范围传播，从而促使养殖户不规范的使用药物进行治疗，最终形成一个恶性循环。

因而，制定一个科学合理的选药和用药制度对于河蟹的养殖具有重要的意义。养殖动物长期处于不良环境中，机体易受到损伤，病害发生频率增加

[11]。目前河蟹的许多传染性疾病因缺乏相关的防治对策的研究而未能得到及时防治，造成了巨大的经济损失[12]。针对河蟹微孢子虫病，目前尚无有效的治疗方法，但是可以按照杀灭寄生虫的方法给予适当的治疗，放养前要彻底清塘消毒、把好蟹种质量关、合理控制放养密度、加强饲养管理；在蜕壳处于“软壳”阶段时，密度不要过大，以免加重互相打斗[13]；使用无公害药物定期或不定期地进行水体消毒，也可使用微生态制剂来改善和稳定池塘环境[14]。还可以从提高河蟹抗病力入手，针对河蟹饲料添加营养因子，提高其抗病力，从而抵抗微孢子虫的感染。

表2 2015年7月—2016年1月江苏省中华绒螯蟹微孢子虫普查情况

图1 微孢子虫普查地区地理位置分布图

[1]杨先乐，黄志华，陈力.中华绒螯蟹病害的流行态势及其对产业发展的思考[J].淡水渔业，2010（40）：74-79.

[2]Despoptes-Livage I.Human microsporidiosis and AIDS：recent advance[J].Parasite，1996（3）：107-113.

[3]王元，房文红，周俊芳，等.脊尾白虾肌肉微孢子虫病的病原和病理分析[J].上海海洋大学学报，2013，22（5）:726-733.

[4]Wu H B，Wu Y S，Wu Z H.Occurrence of a new microsporidium in the abdominal cavity of Epinephelus akaara[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，2005，29（2）：150-154.

[5]农业部渔业局.中国渔业年鉴：2008[M].北京:中国农业出版社，2008.

[6]徐海圣，舒妙安.中华绒螯蟹疾病研究进展[J].渔业现代化，2000（4）:12-14.

[7]Ding Z，Meng Q，Liu H，et al.First case of hepatopancreatic necrosis disease in pond-reared Chinesemitten crab，Eriocheir sinensis，associated withm icrosporidian[J].Journal of Fish Diseases，2016，11（15）：1-9.

[8]谷孝鸿，赵福顺.长江中华绒螯蟹的资源与养殖现状及其种质保护[J].湖泊科学，2001，13（3）：267-271.

[9]沈南平.河蟹养殖业的现状分析与思考[J].渔业致富指南，2005（4）：20-21.

[10]王海表.浅析河蟹养殖存在的问题及发展对策[J].渔业致富指南，2009（3）：12-13.

[11]宋迁红.目前我国河蟹养殖业存在的问题及发展方向[J].科学养鱼，2001（2）：5-8.

[12]马贵华，钟青，刘六英，等.中华绒螯蟹传染性疾病的研究进展[J].内陆水产，2006（11）:16-18.

[13]金珊，李政，陈寅儿，等.梭子蟹养殖中的一种新疾病[J].水产养殖，2003，24（6）:24.

[14]陈寅儿，王国良，金珊，等.三疣梭子蟹肌肉乳化病的同工酶病理变化研究[J].海洋科学，2008，32（5）：36-39.

Investigation report ofm icrosporidian infection on Chinese m itten crab in Jiangsu main cultivation areas

Zhao Yanhua，Liu Hongyan，Ding Zheng feng，Sun Meng ling，Xue Hui
（Freshwater Fishery Research Institute of Jiangsu Province，Nanjing 210017，China）

Chinesemitten crab；infection；microsporidian；investigation report

S945

：A

：1004-2091（2017）01-0011-04

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.003

2016-05-23）

河蟹“水瘪子”病防控关键技术研究与应用示范（Y2016-25）

赵彦华（1986-），女，研究实习员，主要从事水产病害研究.E-mail：njzhaoyanhua@163.com

薛晖（1968-），男，研究员级高级工程师.E-mail：jsxuehui@163.com

Abstradt:An epidemic of hepatopancreatic necrosis disease（HPND）occurred in Chinese mitten crab in Xinghua and Yancheng of Jiangsu province in July，2015.We confirmed it was microsporidian infection caused the HPND after some researches.We used PCR method to know the infection on Chinesemitten crab in Jiangsu main cultivation areas and completed an investigation report.The results showed that the crabswere infected by microsporidian in all the eightareas，especially in Xinghua and Yancheng.