大鳞副泥鳅生长优秀家系筛选以及基因型对生长性能的影响

潘文贤，李彩娟，王国成，叶竹青，凌去非

（1.苏州大学水产研究所，江苏苏州 215123；2..常熟市水产技术推广站，江苏常熟 215500）

大鳞副泥鳅生长优秀家系筛选以及基因型对生长性能的影响

潘文贤1，2，李彩娟1，王国成1，叶竹青1，凌去非1

（1.苏州大学水产研究所，江苏苏州 215123；2..常熟市水产技术推广站，江苏常熟 215500）

本试验构建了11个大鳞副泥鳅家系，并进行了生长性能优秀家系的筛选，利用生长相关SSR标记对各家系进行生长性状与基因型相关分析，探究不同基因型对生长性能的影响。结果显示AB2013F-7、AB2013F-89、AB2013F-45等家系的体质量、体长和全长均值显著（P＜0.05）大于其他家系，其中AB2013F-7家系各生长指标均值最大；以上三个家系117 d内的绝对增重率也表现最好，分别为0.068、0.051和0.048 g/d。对各家系基因型进行分析，显示各家系所拥有优势基因型的数量与生长性状均值大小成正相关，含生长相关标记优势基因型的数量越多，家系的生长性能表现越优秀。

大鳞副泥鳅；家系；生长；基因型；微卫星

家系选择（family selection）是一种选择育种策略，即通过建立家系，对家系后代的经济性状进行有目的的选择和比较分析，是水产动物种质改良的重要途径之一[1]。然而传统的家系选育育种周期长，耗时耗力，需要经历十多代的交配繁殖来获得相关纯系或纯种[2-3]，通过分子标记辅助选择则可缩短育种进程。目前，国内外学者对牙鲆[4]、鲍[5]、马氏珠母贝[6]等进行了分子标记辅助育种相关研究，改善了相关水产动物抗病性以及生长等性状。

大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus Sauvage）是鳅科小型重要经济鱼类，也是近年来养殖规模增长较大的鱼类之一，其味道鲜美，营养价值较高，在国内外市场也广受欢迎。目前分子标记辅助家系选育工作在相关水产动物中得到了一定的应用[7-9]，但国内外均未见大鳞副泥鳅家系选育的相关报道。本研究通过建立大鳞副泥鳅家系，并对家系父母本基因型进行分析，预测子代基因型情况，探讨优势基因型与家系生长性状的关系，为大鳞副泥鳅分子标记辅助选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 家系构建

试验用大鳞副泥鳅由苏州奥博生物科技有限公司泥鳅养殖基地提供。2013年6月6日挑选来自洪泽湖的野生大鳞副泥鳅亲本11组，按照雌雄配比为1∶1进行人工催产，各组亲本分别放于独立水族箱中产卵，产卵后，捞出各家系父母本，剪鳍条保存于95%的乙醇中备用。1 d后鱼苗孵化出膜，2 d后平游，投喂开口饵料。10 d后将11家系移至设置在同一池塘的11个网箱中进行培育，网箱规格为2 m×1m×1 m，网箱网目为80目，每个家系密度控制在1 000尾，培育期间，保持各家系的生长环境尽可能相同。于2013年7月21日再次对试验网箱中各家系密度进行控制，每个家系密度为55尾，并测量各家系的平均初始体质量。2013年11月15日，每个家系捞取30尾，进行生长指标（体长、体质量和全长）测量。

1.2 父母本基因组DNA提取

60尾大鳞副泥鳅基因组DNA的提取参照标准酚-氯仿抽提程序进行。紫外分光光度计测定DNA样品的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳测定DNA基因组的完整性，稀释DNA至50～100 ng/μL，-20℃保存备用。

1.3 引物合成和PCR反应

采用的微卫星标记由本实验室第二代测序技术自行开发获得[10]，由上海生工生物工程有限公司合成引物，11个标记是（表1）本实验室前期已筛选的大鳞副泥鳅生长相关微卫星标记。PCR扩增采用20μL体系：2×Mix 10μL，H2O 7μL，DNA 1μL，上下游引物各1μL（10μM）。整个反应28个循环，94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，各对引物的特异退火温度见表1。首次循环前先预变性3 min，最后一次循环结束后72℃延伸5 min。

1.4 电泳及染色

PCR扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，上样1μL，150 V电泳80 min。参照改良的银染方法检测微卫星带型[10]，染色10min，水洗2次（1 min/次），显色液预冷，显带后水洗；采用凝胶成像系统（BIO-RAD）拍照并分析带型。

1.5 数据处理

表1 11对大鳞副泥鳅微卫星引物信息

采用SPSS 20.0对11个大鳞副泥鳅家系体质量、体长、全长均值进行单因素方差分析（One way ANOVA），利用最小显著极差法（least significant difference，LSD）对各个家系间的测量数据进行多重比较；计算各家系绝对增重率。

绝对增重率AGRW（g/d）=（W2－W1）/（T2－T1）式中W1、W2分别为T1和T2时的体质量。

根据各家系父母本基因型，结合试验1中的各生长相关SSR标记的优势基因型，分析优势基因型对家系生长性能的影响。

2 结果

2.1 大鳞副泥鳅不同家系间生长性能比较

11个家系全长、体长和体质量的平均值、标准差见表2。各家系全长大小关系为：AB2013F-7＞AB2013F-89＞AB2013F-45＞AB2013F-76＞AB2013F-74＞AB2013F-3＞AB2013F-27＞AB2013F-70＞AB2013F-77＞AB2013F-36＞AB2013F-81；体长大小关系为：AB2013F-7＞AB2013F-89＞AB2013F-45＞AB2013F-76＞AB2013F-74＞AB2013F-3＞AB2013F-27＞AB2013F-77＞AB2013F-70＞AB2013F-81＞AB2013F-36；体质量大小关系为：AB2013F-7＞AB2013F-89＞AB2013F-45＞AB2013F-76＞AB2013F-3＞AB2013F-27＞AB2013F-74＞AB2013F-81＞AB2013F-70＞AB2013F-77＞ AB2013F-36。由此可见，AB2013F-7、AB2013F-89和AB2013F-45家系的全长、体长以及体质量均值为所有家系中最高的。通过LSD多重比较发现AB2013F-7号家系全长、体长显著（P＜0.05）大于除AB2013F-89号家系外的其他所有家系，而其体质量显著（P＜0.05）大于所有家系；AB2013F-89和AB2013F-45的全长、体长以及体质量也与其他家系具有统计学意义差异（P＜0.05）（见表2），其他家系之间各指标无统计学意义差异。

同时，本研究也采用绝对增重率来评价家系的生长性能（见表2），AB2013F-7、AB2013F-89和AB2013F-45三个家系117 d内的绝对增重率分别为0.068 g/d、0.051 g/d、0.048 g/d，为11个家系中最高的三个，其中AB2013F-7号家系绝对增重率是AB2013F-36家系的2.8倍。综合多重比较结果与绝对增重率计算结果发现，家系AB2013F-7、AB2013F-89和AB2013F-45生长速度显著快于其他家系，可确定为生长快速家系。

2.2 11个大鳞副泥鳅家系父母本基因分型

采用11个SSR引物对11个家系父母本进行基因分型，并推测出了子代基因型。本研究中的优势基因型为前期已筛选到的优势基因型，基因型统计发现11个家系表现优势基因型的SSR标记个数为1-6个不等（表3），其中AB2013F-3、AB2013F-7家系有6个标记在子代中具备表现优势基因型的机会，为子代优势基因型含量最多的两个家系，其中AB2013F-7家系的表型值也是所有家系中最高的；表现优势基因型最少的家系为AB2013F-27家系，仅有1个标记在子代中表现优势基因型，另外家系AB2013F-36、AB2013F-70、AB2013F-74产生优势基因型的标记在3个以内，AB2013F-27、36、70和74这四个家系其产生优势基因型数量比3个优秀家系的优势基因型数量低，且这4个家系各生长指标均低于3个优秀家系。但是结果中标记数量多少与生长性能的好坏并不是一一对应的，可能是主效基因型与微效基因型对生长影响不同造成的，也可能是父母本基因型在子代中因分离组合导致产生特定基因型个体的概率不同而产生的结果。

表2 11个大鳞副泥鳅家系绝对增重率以及生长性能比较

3 讨论

3.1 优秀家系选择

相关学者认为鱼类生活史的早期阶段生长速度最快，在此阶段，鱼类生长易受到环境以及自身遗传基因的影响，产生生长上的差异[11]。部分学者对大鳞副泥鳅同科的泥鳅进行了研究，认为泥鳅在生长初期遗传差异造成表型差异表现较为显著[12-13]，故本研究采用了6月龄大鳞副泥鳅进行表型值测定。本试验中各家系生存环境和饲喂条件均一致，但11个家系生长差异较大，说明各家系遗传基础的不同导致了生长性能的差异。AB2013F-7、AB2013F-89和AB2013F-45三个家系生长速度较快，可以作为进一步选育的基础群体。

3.2 各家系子代基因型效应对生长影响分析

分子标记聚合育种是将几个主效基因的优势基因型聚合到一个个体上的技术[14]，优势基因型的聚合对于动物品种性状的改良与提升具有很大的促进作用。相关学者在猪[15]产仔数、中国荷斯坦牛[16]产奶性状的优势基因型聚合上进行了研究，研究表明基因聚合能够有效改良目标性状。徐磊[17]等采用8个生长相关分子标记进行了生长优势基因型的数量与大口黑鲈生长速度相关性研究，发现生长优势基因型的数量与生长速度呈正相关。本研究发现各家系能表现优势基因型数量与生长性状均值大小有一定的关系，例如AB2013F-7家系生长速度最快，其优势基因型数量也最多。但也存在例外情况，如AB2013F-3家系有6个优势基因型，比AB2013F-89要多，但生长指标却低于后者，推测原因之一可能是相关标记优势基因型在子代的表现概率大小不同，如在普通家系AB2013F-3家系中，Pda48的优势基因型BF表现概率为50%，而在优秀家系AB2013F-89中为100%；还有可能是主效基因与微效基因相互作用的结果，主效基因与微效基因对性状的贡献大小不同，导致表型值的大小与优势基因型数量不呈直线正相关，例如优秀家系AB2013F-89生长相关标记的数量仅为4个，但Pda48的BF基因型在此家系中表现概率为100%，为所有家系中最大概率，推测BF基因型对生长指标贡献值较大的缘故。AB2013F-7家系优势基因型数量与AB2013F-3家系相同，但是标记的种类和各标记的表现概率不同，这可能是导致两家系生长状况差异的原因。Pda261的优势基因型在AB2013F-7家系中表现概率为100%，在AB2013F-3家系中为50%，而Pda316的优势基因型在AB2013F-3家系中表现概率为100%，在AB2013F-7家系中为50%，但是AB2013F-7家系表型值显著大于AB2013F-3家系，推测可能Pda261位点连锁基因对生长的贡献值大于Pda316。

Pda247、Pda315在11个家系父母本中没有相关优势等位基因，但可以通过在另外的群体（混合选育群体）中选择具有优势等位基因的个体与家系个体交配，从而引入优势基因型。有的家系虽未表现优势基因型，但是却含有组成优秀基因型的等位基因，也具备育种潜力，如Pda371在普通家系AB2013F-3子代中为AB基因型，如果家系内个体交配，则可产生含优势基因型AA个体。在非优势家系中，一些标记也能产生优势基因型，优势家系中也不是全部标记都可以产生优势基因型，主要因为生长相关标记属于数量性状，其最终表现需要多基因的协同作用，主效基因与微效基因对生长速度的影响效果差别较大，仅从有无优势等位基因及优势基因型的数量多少来判断家系的好坏有一定的局限性，因此，后期研究应重点加强主效基因标记优势基因型的甄别和富集以进一步加快良种选育进程。

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湖北荆门发布通知2017年年底前全部拆除全市养殖网箱

记者从2016年12月拟订的《关于取缔湖库围栏围网网箱养殖的实施方案》上了解到，关于湖库围栏围网网箱养殖的目标为：通过规范整治，在荆门市境内实现水域无珍珠养殖、湖库无围栏围网（网箱）、水库无投肥投饵养殖的“三无”目标。到2016年12月底前全市拆围达到30%以上，2017年12月底以前全面拆除完成；全市湖库水质明显改善，饮用水源区湖库水质达到Ⅲ类标准以上。到2020年，所有湖库水质全部达标。

根据方案，从现在起至2017年6月，全面启动拆围工作。从2017年6月至8月开展联合整治。严格控制在湖库集水区范围内新增污染物排放设施。对公共水域水面渔业养殖权和捕捞权对外承包，在2017年8月底前全部收回，并注销《水域滩涂养殖证》。对不按照规范时间拆除的，由公安、环保、水务、水产等具有执法权的单位联合予以强制拆除。从2017年9月至11月，对湖库进行全面巡查检查，防止反弹，对已经治理仍然进行珍珠养殖、围栏围网（网箱）养殖的依法予以处罚，发现一起查处一起。

（www.bbwfish.com）

Screening fast-grow ing fam ilies and analysis of the effect of genotypes on grow th of Paramisgurnus dabryanus

Pan Wenxian1，LiCaijuan2，W ang Guocheng2，Ye Zhuqing2，Ling Qufei2
（1.Fisheries Institute of Soochow University，Suzhou 215123，China 2.Fisheries Technology Extension Station of Changshu city，Changshu 215500，China）

Eleven families of large-scale loach were established and fast-growing families were screened by comparing growth traits among the families，and growth-associated SSRswere used to analyze the effect of genotype on growth by genotyping.The results bymultiple comparisons showed that：themean value of body length，total length and body height of family AB2013F-7，AB2013F-89 and AB2013F-45 were significantly greater than other families（P＜0.05）；with family AB2013F-7 growing fastest in all three growth traits.During the 117 days of cultivation，the three families with the highest daily weight gain were AB2013F-7，AB2013F-89 and AB2013F-45（0.068 g/d，0.051 g/d and 0.048 g/d respectively）.The results of genotyping of 11 pairs of parents showed that the growth rate of each family were in accord with the number of growth associated dominant genotypes.The number of dominant genotypes of each families and the mean of growth trait was positive correlation. Themore dominantgenotype the family had，the faster the growth rate of the family.

Paramisgurnus dabryanus；family；growth；genotype；SSR

Q173

：A

：1004-2091（2017）01-0001-06

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.01.001

2016-04-29）

江苏省科技厅农业重大科技支撑项目（BE2012354）；江苏省水产三项工程项目（PJ2011-62）；江苏省农业自主创新项目[CX（13）2042]

潘文贤（1958-），男，工程师，研究方向水产养殖.E-mail：PWX8210@163.com

凌去非，教授.E-mail：lingqf@suda.edu.cn