油茶籽油中角鲨烯的高效液相色谱分析

马力��+陈永忠��+钟海雁��+周波��+彭邵锋��+李志钢��+王湘南��+王保明��+彭映赫��+王瑞

摘要：建立了油茶籽油中角鲨烯的HPLC测定方法。样品采用硅胶柱提纯处理优于皂化处理、皂化处理后硅胶柱提纯处理，得到的色谱峰杂峰少、角鲨烯峰型对称、峰面积较大。最佳色谱条件为C18柱，流动相V乙腈 ∶[KG-3]V甲醇为 40 ∶[KG-3]60，检测波长210 nm，流速为1 mL/min，柱温为40 ℃。该方法下角鲨烯在0.01～0.4 mg/mL 范围内浓度和面积呈现良好的线性关系，相关系数为0.999 6；平均回收率100.28%（RSD=1.9）；精密度RSD（n=6）为1.24%；可用于实验室检测油茶籽油中角鲨烯的含量。

关键词：油茶籽油；角鲨烯；高效液相色谱；流动相；色谱条件

中图分类号： O657.7文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0353-04

油茶籽油含角鲨烯、维生素E等活性成分，赋予其与众不同的营养保健作用。角鲨烯是具有促进血液循环、细胞修复、抗氧化和消炎杀菌等功能的天然活性成分[1-3]，广泛用于医疗保健品和化妆品等方面。目前角鲨烯软来源主要是深海鱼类，植物性来源的角鲨烯较少。已知苋属植物种子油中角鲨烯含量可达5%～8%，甘草根、带皮种子和去皮种子中角鲨烯含量分别为0.2%、0.104 5%、0.078 1%，橄榄油、棕榈油、玉米油和米糠油等也含一定量的角鲨烯。角鲨烯的检测尚未有相关国家标准或者规范性文件[4]，在现有的研究中大多采用薄层层析法（TCL）、气相色谱法（GC）和液相色谱法（HPLC）[5]。但薄层层析法人工影响因素较多；气相色谱法需要前期对检测物进行衍生处理，易引入新的杂质，费时费力。本试验采用TCL定性测定油茶籽油中是否含有角鲨烯，采用waters C18反相极性色谱柱考察流动相及流动相比例、流速及柱温对油茶籽油中角鲨烯分离效果的影响。

1材料与方法

1.1试验材料、仪器与试剂

1.1.1试验材料供试的油茶籽由湖南省林业科学院提供。

1.1.2试剂甲醇、乙腈和正己烷，均为色谱纯；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸银、石油醚、氢氧化钾、硫酸钠和角鲨烯，均为分析纯；柱层层析硅胶，为试剂级。

1.1.3试验仪器榨油机，湖南省林业科学院自制；DHG-9070A型電热恒温箱，北京佳源兴业科技有限公司生产；SZF-06GI粗脂肪测定仪，上海新嘉电子有限公司生产；KQ-700DV数控超声波清洗器，江苏省昆山市超声仪器有限公司生产；P10-Y实验室超纯水器（国之源）；LC-2010AHT液相色谱仪，日本岛津公司生产。

1.2试验方法

1.2.1测定油样的制取称取1～1.5 kg油茶籽，置于干燥箱105 ℃干燥至恒质量后，用压榨机提油，将油静置、除杂后，备用。

1.2.2角鲨烯测定条件优化

1.2.2.1角鲨烯的定性分析用10 cm×20 cm硅胶 GF254薄层层析薄板鉴定油茶籽油中是否含有角鲨烯。

点样：在距薄层层析板1侧的底部1 cm处画好1条直线作为起点线，用毛细管分别吸取标准角鲨烯溶液和油茶籽油样品垂直轻轻地接触到起点线上，样点间距为1～1.5 cm。

显色：将展开剂加入到层析缸中，将层析缸密封1 h，然后将薄层层析板放入进行展开，当展开剂的前沿已到达薄层层析板上端0.5～1 cm时，迅速取出薄层层析板，晾干。将除去展开剂的层析板，碘缸显色20～30 min，即出现黄色斑点，取出后计算Rf值。Rf值为斑点中心距原点的距离与溶剂展开前沿距原点距离的比值。

1.2.2.2角鲨烯预处理优化

角鲨烯标准溶液的配制：称取0.1 g的角鲨烯标准品于10 mL的容量瓶中，用正己烷定容至刻度并摇匀，配制成浓度为10 mg/mL的角鲨烯标准品溶液。

角鲨烯样品预处理条件的优化分3种不同的处理方法。

处理1（A）：皂化处理。称取1 g油茶籽油于250 mL的磨口锥形瓶中，加入2 mol/L的KOH-乙醇溶液50 mL，连接好回流装置，在85 ℃的恒温水浴锅中回流1 h，移出后冷却至室温。将皂化液转入250 mL的分液漏斗中，加入饱和氯化钠溶液50 mL，然后加入50 mL石油醚，充分振摇萃取，静置分层后将上层溶液转入250 mL的分液漏斗中，下层溶液再用50 mL 石油醚萃取2次，合并3次的上层有机相溶液，用去离子水洗至中性，然后过无水硫酸钠脱水，在35 ℃水浴中旋转蒸发至近干，用正己烷定容至2 mL，混匀后，过0.45 μm微孔滤膜于进样瓶中，作为待测液。

处理2（B）：硅胶柱提纯处理。采用湿法装柱法，将硅胶柱固定于铁架台上，倒入约100 mL的石油醚，称取10 g经500 ℃烘干的硅胶，慢慢倒入硅胶柱中，静置片刻，再加入 0.5 cm 无水硫酸钠（约2 g），打开塞子，使石油醚缓慢淋洗下来，确保柱中硅胶填料均匀，不出现气泡和断层现象。称取 1 g 左右的油茶籽油样品放置于小烧杯中，用少量石油醚分数次润洗小烧杯，洗涤液一并倒入小柱中，加入50 mL石油醚于硅胶柱中，打开旋塞，收集滤液，当石油醚液面与上端无水硫酸钠层相切时，再分2次加入50 mL石油醚，收集全部的洗脱液至锥形瓶中，用旋转蒸发仪浓缩滤液，然后用氮吹仪氮吹至干，随后用正己烷定容至2 mL，充分振摇，过0.45 μm微孔滤膜，作为待测液转移到进样瓶中。

处理3（C）：皂化处理后硅胶柱提纯处理。按处理1皂化萃取后，再按处理2硅胶柱提取。

1.2.2.3角鲨烯高效液相色谱测定的条件优化

流动相选择：在流速为1 mL/min和柱温40 ℃的相同条件下，改变流动相，考察甲醇、乙腈、甲醇/乙腈（V/V，50/50）体系对分离效果的影响。

流动相比例的选择：在流速为1 mL/min和柱温40 ℃的相同条件下，选择较优的流动相比例，考察流动相比例对分离效果的影响。

柱温的选择：在乙腈/甲醇（V/V，40/60）作为流动相和流速为1 mL/min的相同条件下，改变柱温（35、40、45 ℃），考察柱温对分离效果的影响。

流速的选择：在流速为1 mL/min和柱温40 ℃的相同条件下，改变流速（0.8、1.0、1.2 mL/min），考察流速对分离效果的影响。

2结果与分析

2.1薄层层析法（TLC）定性检测油茶籽油中的角鲨烯

由图1可知，在Rf=0.662处有一个黄色斑点，斑点非常清晰，未产生拖尾，与角鲨烯标准品完全一致。说明油茶籽油中含有角鲨烯。

2.2预处理条件的测定结果

采用3种不同的预处理方法对油茶籽油样品进行处理，处理后的色谱图如图2至图4所示。

由图2至图4可知，油茶籽油经不同的预处理方法得到的角鲨烯HPLC图谱差异很大。经皂化处理后的HPLC图谱杂[CM（25]质峰较多，目标峰（角鲨烯）附近有干扰，损害色谱柱，且皂[CM）]

化时间过长。经硅胶柱提纯处理后的HPLC图谱峰形较好，附近没有杂质峰的干扰，方法简单且角鲨烯峰型对称、峰面积较大。经皂化处理和硅胶柱提纯处理后的HPLC图谱与硅胶柱提取后的HPLC图谱处理的效果差别不大，但角鲨烯峰面积偏低，且操作过程较为繁琐，因此硅胶柱提取法是一種较优的预处理方法，最终能使角鲨烯得到良好的分离效果。

2.3角鲨烯检测高效液相色谱法条件的研究

2.3.1流动相的选择

由图5可知，采用乙腈作为流动相，由于乙腈具有较强的洗脱能力，图谱中仅有1个大峰，溶剂峰与目标峰没有分开。采用甲醇和甲醇/乙腈（V/V，50/50）分离效果均较好，因乙腈较甲醇使柱内承受的压力低，考虑到色谱柱的使用寿命，选用甲醇/乙腈作为流动相。

2.3.2流动相比例的选择由图6可知，样品在不同比例的流动相条件下都能与杂质峰分开，但是随着乙腈比例的增加，样品的保留时间增加，当乙腈增加到60%时，样品主峰的保留时间为29 min。一般情况下，因乙腈的洗脱能力较甲醇强，增加乙腈的比例，样品的保留时间缩短，但在本试验中，随着乙腈的比例增加，样品的保留时间反而延长，这可能与角鲨烯的特有性质有关。为缩短样品的保留时间，选择乙腈/甲醇（V/V，40/60）作为流动相。

2.3.3柱温的选择

柱温是最重要的色谱操作条件，它直接影响色谱柱的选择性、色谱峰区域展宽和分析速度[6]。由图7可知，在柱温为35、40、45 ℃时，峰形有一定的变化，但在试验中观察到峰面积变化很小；样品主峰跟其他杂质峰均分离良好，样品的保留时间随着柱温的升高都前移了。因柱温太高容易损伤色谱柱，综合考虑样品的保留时间和柱子的使用寿命，柱温选择40 ℃。

2.3.4流速的选择

由图8可知，在流速选择0.8、1.0、1.2 mL/min 时，样品主峰跟其他杂质峰均分离良好，流速增大时，峰宽变小，但峰面积变化不大。样品的保留时间随着流速的增大而缩短。同时，随着流速的增大，柱压会上升。综合

考虑分析时间及柱子使用寿命，流速选择1.0 mL/min。

2.4高效液相色谱法检测角鲨烯的效果评价

2.4.1标准角鲨烯浓度与峰面积的线性关系

量取一定量10 mg/mL的标准溶液，用正己烷稀释，配制成浓度分别为001、0.05、0.10、0.15、0.20、0.40 mg/mL的标样，按选定的色谱条件，取10 μL进样，记录色谱图，测定其峰面积，以峰面积（y）对质量浓度（x）进行线性回归，建立标准曲线图（图9）及线性回归方程。

线性回归方程y=4×107x+198 720，r2=0999 6，线性范围0.01～0.4 mg/mL。

2.4.2稳定性试验

精确称取油茶籽油样品1 g，经硅胶柱提取处理后用正己烷定容至2 mL，每隔8 h进样10 μL，按照优化的色谱条件进行定量分析。稳定性试验结果见表1。根据表1，计算出RSD为1.26%，说明用本试验方法制成的供试样品溶液中的角鲨烯在24 h内稳定。

2.4.3回收率试验

加标回收率是表示准确度的一个指标。称取已知角鲨烯含量（80.02 μg/g）的油茶籽油样品，再添加5 μL 角鲨烯标准品溶液。经硅胶柱提取处理后用正己烷定容至2 mL，进样10 μL，按照优化的色谱条件进行定量分析，重复3次，回收率试验结果见表2。

根据表2，得到该试验方法的平均回收率为100.28%，RSD为1.9%，说明该方法的回收率良好，即测定方法有良好的准确度，是可靠的。

2.4.4精密度的测定

柱温为40 ℃。该方法下角鲨烯在0.01～0.40 mg/mL范围内浓度和面积呈现良好的线性关系，相关系数为0.999 6，平均回收率100.28%（RSD=19%），精密度RSD（n=6）为124%。该方法可用于实验室检测油茶籽油中角鲨烯的含量。

液相色谱法[7-8]已应用于甘草[9-10]、罗汉果[11]中角鲨烯含量的测定，但应用于油茶籽油的检测中尚未有报道。本研究建立了油茶籽油中角鲨烯的HPLC测定方法，对建立油茶籽油中角鲨烯含量测定的标准方法具有参考价值。

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