应用高效液相色谱—二极管阵列检测器优化棉花体内多胺的测定方法

张一名��+刘玲玲+谢韫泽��+孙艳香+冯雪��贾永红

摘要：应用高效液相色谱-二极管阵列检测器法（HPLC-DAD）对棉花体内多胺测定时的流动相比例及流速、多胺全光谱信息等进行分析，重点比较2种常用检测波长230、254 nm下的测定参数。最终确定检测波长为230 nm、流动相体积比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速为0.6 mL/min为最佳色谱条件。该方法有较好的准确度、灵敏度，腐胺、亚精胺、精胺的回收率分别为98.58%、96.98%、99.62%，且非常稳定。以此色谱条件为基础测定棉花幼苗不同组织中多胺水平发现，叶片中3种多胺的含量明显高于根、茎组织；此外，不同组织内亚精胺含量最高。

关键词：棉花；幼苗组织；多胺含量；高效液相色谱；二极管阵列检测器

中图分类号： S562.01文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0328-04

多胺（polyamines，PAs）是一类含有多个氨基的长链脂肪族化合物，广泛存在于生物体内。在植物代谢途径中，目前比较清楚的多胺形式主要有腐胺（putrescine，Put）、亚精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm）[1-2]。研究表明，多胺在植物体内是一类重要的生长调节因子，参与植物的细胞分裂[3-4]、性别分化[5]、果实成熟与衰老[6]、逆境适应[7-10]等重要生理过程。在分子水平的研究中还发现，多胺参与DNA的复制、转录、膜稳定、RNA和蛋白质的翻译[11]、DNA凝聚及激素的调控[12]等过程。另外，在人体中也存在大量多胺类物质，并与人类健康息息相关[13]。由于植物性食物是人体内多胺的重要来源之一[14]，因此，如何准确而快速地检测植物组织中的多胺技术越来越受到人们的重视。

多胺的测定以前主要用氨基酸分析仪、纸电泳等方法[15-16]，这2种检测方法样品回收率低，检测灵敏度也不高。目前多用衍生化的方法，即将多胺的一、二级氨基接在卤素原子上，另外还有接在荧光基团或对紫外有吸收的基团上，再通过气相（GC）或液相（HPLC）方法进行分离检测。其中，气相色谱刚刚应用在植物多胺的研究方向，虽然分析时间短，但是对试样要求高，前处理过程比较复杂[17]，并且应用质谱检测设备价格昂贵，且分离检测效果没有显著提高。自从1979年Redmond等采用苯甲酰化的方法以来，随着不断改进，高效液相色谱法已经成为较为成熟的检测植物体内多胺的方法[18-21]。目前主要应用荧光检测器（FLD）、紫外吸收检测器（UV）。其中，FLD法检测多胺的主要优势在于灵敏度高[22]，但要用到有毒流动相乙腈。另外，由于瑞利散射、拉曼散射的干扰，使荧光检测方法的条件构建和优化过程较为复杂，没有一定的专业基础较难完成。而紫外吸收法虽然灵敏度并不突出，但是可以用于植物体内多胺含量的测定，加上流动相中的甲醇毒性较低、仪器成本较低等优点，使得紫外吸收法成为当今国内用于测定植物多胺最常用的一种方法。

目前对于紫外吸收法检测波长的选择主要是苯甲酰氨基特征峰230 nm处、苯基特征峰254 nm处[15-16，18，23]。以上2种选择对于多胺的检测虽然都有一定的根据，但是对于检测效果尚缺乏科学的比较。本研究应用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）广谱记录光谱信息，同时针对棉花幼苗组织样本特点比较230、254 nm 2种检测波长的操作性、可靠性，最终优化建立了可应用于UV检测器的棉花幼苗组织样本中3种多胺的检测方法，并依据该方法比较棉花幼苗根、茎、叶组织内多胺含量的差异。

1材料与方法

1.1试验材料

供试棉花种子由廊坊师范学院生命科学学院遗传与育种研究所提供，为农大棉7号。

1.2试验方法

1.2.1棉花幼苗组织中多胺的提取取1.0～2.0 g棉花3叶期幼苗的不同新鲜组织，液氮研磨后加入4 mL预冷的5%高氯酸溶液，冰浴浸提1 h后离心（12 000 r/min，30 min，4 ℃）；取上清液为样液，4 ℃保存备用。

1.2.2样品的苯甲酰化取500 μL样液，加入10 mL离心管中，先后加入14 μL苯甲酰氯、1 mL 2 mol/L氢氧化钠溶液，振荡混匀后于37 ℃水浴反应20 min；加入2 mL饱和氯化钠溶液，混匀后用2 mL乙醚萃取，离心（1 500 r/min，5 ℃，5 min）后取1 mL乙醚相真空干燥，用100 μL甲醇溶解后，用0.22 μm孔径有机相滤膜过滤，即可进样[21]。

1.2.3色谱条件的优化色谱仪：Agilent 1260 Infinity；色谱柱：[JP3]Agilent ZORBAX SB-C18 Stable Bond Analytical 4.6 mm×150 mm。

流动相与流速：综合华永有等方法[22，24]，以甲醇、水混合物为流动相，测试甲醇体积分数为50%～90%时不同流动相的色谱性能，每变化10%进样测定1次，确定最佳流动相比例。通过比较流动相流速为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL/min的检测效果，确定最佳流速。

检测波长：以二极管阵列检测器收集190～900 nm区間内的吸光度数据，重点比较多胺在230、254 nm下标准曲线质量、回收率、标准偏差（RSD，%）、峰型，再结合3种多胺的光谱信息确定适合的检测波长。

柱温：30 ℃[21]。

时间：不限制。根据分析中杂质的具体洗脱情况，设定合理的分析时间。

1.2.4标准曲线的制作精确配制0.2 μmol/mL多胺标准溶液，苯甲酰化衍生后，将标准液稀释为0.3、0.6、1.2、2.5、5.0、7.5、10.0 nmol/mL，取10 μL进样；用安捷伦化学工作站（Agilent ChemStation）对230、254 nm信号数据进行分析，分别建立校正曲线。

1.2.5棉花叶片多胺回收率的测定取棉花叶片，抽提得到测定样液，苯甲酰化衍生后取10 μL进样测定，在230、254 nm 2个检测波长和标准曲线下各自得到样品中3种多胺的含量数据。再分别将3种不同浓度苯甲酰化后的多胺標准样品加入到已知浓度的样品多胺提取液中，并测定回收值[23]。根据样品含量、加标量和所测得回收值分别计算回收率及其标准偏差。

1.2.6棉花幼苗不同组织中多胺含量测定按照“1.2.1”“1.2.2”节中的相应方法得到棉花幼苗根、茎、叶组织样液，并进行衍生化。按照试验最终确定的检测条件，对棉花幼苗不同组织内的3种多胺含量进行检测，重复3次。

2结果与分析

2.1流动相条件的优化

通过比较不同比例的流动相以及不同流速下多胺的检测效果，发现流动相体积比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速为 0.6 mL/min 时，多胺的分离度、信号峰型较好，且棉花叶片样品中目标峰信号与其他杂峰无明显叠加；在此条件下，Put、Spd、Spm的保留时间分别约为5.09、9.30、17.75 min；并且，检测样液中存在的残留苯甲酰氯峰（7 min左右）对检测整体无影响（图1）。

2.2检测波长的确定

2.2.12种检测波长下标准曲线的建立与比较标准曲线的制作在流动相体积比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20，流速为 0.6 mL/min，检测波长分别为230、254 nm的色谱条件下进行。数据由安捷伦化学工作站（Agilent ChemStation）处理并分别建立校正表，回归方程见表1。从试验结果可知，230、254 nm检测波长下多胺Put、Spd、Spm回归方程的决定系数（r2）[CM（231]均大于[KG5]0.99，说明2种波长均能够应用于棉花幼苗组织[CM）]

内多胺含量的测定；但是通过比较可以看出，波长为 230 nm 时回归方程的r2均高于波长为254 nm下的r2。因此本研究表明，从标准曲线决定系数的角度考量，检测波长为230 nm 要优于254 nm。

2.2.22种检测波长下回收率标准偏差的测定由表2可以看出，在230 nm检测波长下，Put、Spd、Spm的平均回收率均在95%以上，分别为98.58%、96.98%、99.62%，RSD分别为1.56%、0.78%、0.95%。当检测波长为254 nm时，回收率均超过100.00%，且该检测波长下RSD较高，分别为540%、9.49%、2.93%。说明当检测波长为254 nm时，尽管有较高的回收率，但是检测数据的稳定性下降，检测误差增大。因此，从回收率RSD的角度评价可知：230 nm较254 nm更适合作为检测波长测定棉花样品中的多胺含量。

2.2.32种检测波长下的峰型比较如图2所示，比较230、254 nm下棉花幼叶等量程色谱图可以发现：检测波长为 230 nm 时，3种多胺的响应值较大，虽然同时也增大了部分杂质及副反应的响应峰值，但是目标峰仍然明显；254 nm作为检测波长时，虽然杂质响应较小，但是3种多胺的信号响应值同样较低。

2.2.43种多胺的吸收光谱信息用二极管阵列检测器（DAD）分别收集3种多胺信号峰在波长190～900 nm的光谱信息。由图3可见，3种多胺在200 nm处有最高吸收峰，230 nm 左右均有明显的第2吸收峰。由于多种物质在 200 nm 处均存在光谱吸收峰，可使基线漂移严重，而在 230 nm 的第2吸收峰附近杂质相应明显减少（图4）。因此根据3种多胺各自的光谱信息分析可知：选择检测波长在230 nm左右的第2吸收峰要优于其他波长。

[CM（24]综上所述，棉花幼苗组织内3种多胺含量的色谱检测应[CM）]

2.3分析时间的确定

在棉花幼叶样品的不限时检测中，保留时间在30～32 min 仍有不规则杂峰（图2、图4），而32 min后信号基本回归基线。因此，为洗脱杂质的同时保留完整数据，设定单针样品的分析时间为35 min，且无后运行为宜。

2.4棉花幼苗不同组织的多胺含量比较

依据前期试验结果得出：流动相体积比为V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20、流速为0.6 mL/min、检测波长为230 nm为最适合的色谱条件。对棉花根、茎、叶组织进行3种多胺含量的测定，结果表明，多胺在棉花幼苗组织中含量普遍偏少，响应值较低，均在nmol/g水平。如表3所示，所测组织中Spd含量最高，在不同组织内的含量均高于Put、Spm含量；另外，棉花幼苗叶片组织中的3种多胺总含量为（41.90±1.56） nmol/g，远远高于根的（18.18±2.61） nmol/g、茎的（12.97±2.52） nmol/g。

3结论与讨论

3.1色谱条件的优化

以往研究表明，多胺的次级胺基与柱子硅羟基的相互作用，可引起在不同的流动相条件下，保留时间会产生较大变化[23]。本研究选择流动相体积比V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20，可以减少洗脱时间、降低分析时间。采用流速为0.6 mL/min，即可将样品中各个组分比较清晰地分离开来。以上结果优化了之前报道的相关方法[15，22，24]，得出了专门针对棉花幼苗组织内多胺含量检测的可靠色谱条件。

有报道显示，衍生化过程中的苯甲酰氯残留会对多胺色谱分析产生一定影响[24]。本试验表明，Put、Spd、Spm的保留时间分别为5.09、9.61、17.75 min，苯甲酰氯的保留时间约为7.21 min，避免了苯甲酰氯、腐胺的峰重叠现象，并且3种多胺信号与组织样品中其他杂峰信号互不干扰。

3.2检测波长的比较

对于目前检测多胺含量常用的2种检测波长230、254 nm，笔者所在实验室以二极管阵列检测器收集190～900 nm 区间内吸光度数据发现：3种多胺检测波长约为 230 nm 时，均为第2高吸收峰，且苯甲酰氨基的显色受多胺脂肪链及其他副反應杂质的影响不大；而以254 nm作为检测波长时，虽然杂质响应较小，但3种主要多胺的信号响应值同样较小，使标准曲线的线性相关性等降低。因此，在多胺本底水平比较低的棉花幼苗上不适用254 nm波长，选择 230 nm 波长为宜。

3.3优化的方法以及所得检测结果分析

如前文所述，最终确定最佳色谱条件：检测波长为 230 nm，流动相体积比为V甲醇 ∶[KG-3]V水=80 ∶[KG-3]20，流速为 0.6 mL/min。

按照以上方法，棉花幼苗组织多胺含量检测结果显示，幼苗期棉花组织内Spd含量在3种多胺中最高。该结果可能表明，在植株的快速生长期，Spd起一些重要的作用[25-26]。在棉花组培苗组织内多胺的研究中，Spd在球形胚形成期含量显著升高，明显高于Put、Spm，报道中对这些现象的解释是高水平Spd可能有助于细胞分化[27-28]，但是具体的代谢以及调控方式正在进一步研究中。

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[FK（H02642/3。54ZQ]

〖HTH〗更正：《江苏农业科学》2016年第44卷第6期338-340页所刊论文《不同组合尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼的繁育比较》，第一作者应该为黄培铃，特此更正。