黄曲霉毒素B1生物降解菌的快速筛选及鉴定

闵勇+徐琳+刘晓艳+高天雨+王开梅+杨自文

摘要：通过48孔板微培养的方法对336株芽孢杆菌菌株进行黄曲霉毒素B1生物降解菌的快速筛选，获得14株能在以香豆素作为惟一碳氮源的培养基中生长的芽孢杆菌菌株。在投料浓度为100 μg/kg条件下，对这14株芽孢杆菌进行复筛，获得1株黄曲霉毒素B1降解率为83.20%的芽孢杆菌菌株。通过16S rDNA序列比对分析，初步确定这株芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。

关键词：黄曲霉毒素B1；生物降解；香豆素；巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）

中图分类号：S852.66 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）20-5249-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.021

Abstract： Rapid screening of Aflatoxin B1 biodegration strains was carried out through microcultivation in 48 rectangular well deep well plates. 336 Bacillus strains were screened and 12 strains could grow in the media using coumarin as the sole source of energy and carbon. The 14 strains were re-screened in the media containing 100 μg/kg Aflatoxion B1. One strain which the biodegration ratio of Aflatoxin B1 reached 83.2% was obtained. After gene sequencing and sequence alignment of 16S rDNA，the strain was preliminarily identified as Bacillus megaterium.

Key words： Aflatoxin B1； biodegration； coumarin； Bacillus megaterium

黄曲霉毒素（Aflatoxin AFT）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和特异曲霉（Aspergillus nomius）等多种真菌在生长过程中产生并分泌的一类结构相似的次级代谢产物，主要包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a和AFGM2a等，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）分布范围最广、化学性质最稳定，且是黄曲霉毒素中毒性最强的，具有很强的致癌性、致突变性、致畸性和强免疫抑制性等作用[1]。黄曲霉毒素常存在于各种动物饲料和人类食品中。用污染的饲料饲养畜禽，会导致肉、乳及其制品的污染，人类食用被污染的食品会导致急性中毒，引起肝脏坏死出血，慢性中毒可引起肝癌，严重的可造成死亡[2，3]。因此，在实践中采取必要可行的措施减少和消除AFB1带来的危害刻不容缓。

AFB1的传统脱毒方法有碱处理法、氧化处理法、高温法、吸附剂法和抗氧化剂法等。但是这些方法具有破坏营养、去毒不彻底和成本高等缺陷，实际的防控和脱毒效果并不理想[1，4]。目前，AFB1的生物脱毒技术越来越成为研究的热点，该技术主要利用微生物的代谢产物，如酶类，分解破坏AFB1产生低毒或无毒的降解产物。微生物及生物酶脱毒因具有解毒效率高、特异性强、对饲料和环境无污染等特点和优势而备受研究者重视。已发现多种微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌和藻类等均有降解AFB1的能力。

本研究以香豆素为惟一碳氮源，通过48孔板培养的方式对实验室保存的336株芽孢杆菌进行初筛，将长势良好的菌株与AFB1在48孔板中共培养，然后采用ELISA试剂盒测定AFB1降解率的方法进行复筛，筛选到了2株高效降解AFB1的菌株，并对其中一株菌株进行了16S rDNA鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

试验菌株：湖北省生物农药工程研究中心从土样中分离并保存的336株芽孢杆菌。

种子培养基LB配制方法参照文献[5]；初筛培养基：KH2PO4 0.5 g、NH4NO3 2.0 g、CaCO3 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 20 mg，溶于1 000 mL去離子水中（pH 7.0），121 ℃灭菌20 min，灭菌的无机盐培养基与过滤除菌的0.2%香豆素水溶液等体积混合，即为初筛培养基；复筛培养基：酵母粉3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖6.0 g、NaCl 10.0 g，溶于1 000 mL去离子水中（pH 7.0）。

1.2 方法

1.2.1 芽孢杆菌活化 在48孔板中每孔各加入1 mL LB培养基，灭菌后接种芽孢杆菌菌株，将48孔板置于96孔板混匀仪上于37 ℃、200～250 r/min条件下振荡培养48 h。

1.2.2 AFB1生物降解菌的初筛 在灭菌后的48孔板中每孔加入800 μL的香豆素初筛培养基，吸取200 μL活化好的芽孢杆菌菌液并将其转移至初筛培养基中，于30 ℃、200～250 r/min条件下振荡培养72 h，挑取生长良好的菌落，转接于新鲜的香豆素初筛培养基中继续培养，如此重复3～4次。

1.2.3 AFB1生物降解菌的复筛 为避免细胞在原环境中的碳氮源干扰，对能在以香豆素为惟一碳氮源培养基中生长的菌株进行复筛。在48孔板中每孔加入800 μL复筛培养基，灭菌后接种需要进行复筛的芽孢杆菌菌株。将48孔板置于96孔板混匀仪上，于30 ℃、200～250 r/min条件下振荡培养24 h，然后每孔加入200 μL AFB1（500 μg/kg，终浓度为100 μg/kg），于30 ℃继续振荡培养72 h。

1.2.4 AFB1提取和竞争性酶联免疫方法（ELISA）测定 提取方法参考文献[6]，AFB1含量按间接竞争ELISA方法操作，具体见百奥森科技公司产品说明书，待测空白对照孔的AFB1终浓度为2 μg/kg。450 nm酶标仪读数，对照标准曲线计算处理的AFB1含量及降解率。计算公式如下：

式中，x1代表空白对照AFB1含量（2 μg/kg）；x2代表处理的AFB1的含量；y代表降解率。

1.2.5 菌株的鉴定 ①形态观察。菌株接种于LB培养基平板上，37 ℃培养48 h，观察菌落形态、色泽，显微镜观察细胞形状等；②细菌16S rDNA序列测定。A.按照参考文献[5]中方法提取细菌基因组DNA；B.16S rRNA基因序列的PCR，引物（27F 5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′；l492R 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）；C.PCR扩增产物送上海生工生物工程有限公司纯化、测序；D.测序结果在NCBI使用Blast比对，从GenBank数据库中获得与菌株16S rDNA同源的公认标准序列数据。

2 结果与分析

2.1 AFB1降解菌株的初筛

通过48孔板微培养，对336株芽孢杆菌，共计7板菌株进行了初筛，经过3次转接，获得14株能在以香豆素作为惟一碳氮源的培养基中生长的芽孢杆菌菌株（表1）。

2.2 AFB1标准曲线制作

将系列AFB1标准溶液（0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 μg/kg）测得的吸光度OD值，测得不同AFB1含量下对应的吸光度A450，如表2所示。

以横坐标为标准溶液浓度的常用对数值（lgC），纵坐标为各标准孔OD值与0 μg/kg标准孔OD值的比值[B样品/B（0 μg/kg）]，绘制散点图并添加线性趋势线，得到AFB1标准曲线见图1。由图1可知，AFB1含量与各标准孔OD值与0 μg/kg标准孔OD值的比值[B样品/B（0 μg/kg）]的关系式，即线性回归方程y=-29.503x+84.158，R2=0.995 9，说明变量y的变异中有99.59%是由变量x引起的，拟合优度较好，故可根据此方程来计算AFB1的含量。

2.3 AFB1降解菌株的复筛

筛选出的14株芽孢杆菌菌株降解AFB1能力的结果见表3。由表3可知，14株芽孢杆菌均具有降解AFB1的能力，根据空白对照AFB1含量为2 μg/kg，计算各处理降解率。其中，CC6菌株和EF4菌株AFB1降解率分别达83.20%和79.10%，明显优于其他菌株。

2.4 菌株分子鉴定

将CC6芽孢杆菌菌株16S rDNA基因序列在NCBI中经Blast比对，从GenBank数据库中获得有关种的公认标准序列数据进行系统发育分析（图2）。由图2可知，CC6菌株与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）位于同一个分支，同源性达100%。

3 小结与讨论

本研究通过48孔长方形深孔板微生物培养的方法，对实验室保存的336株芽孢杆菌菌株进行了AFB1生物降解菌的快速筛选，获得14株能在以香豆素作为惟一碳氮源的培养基上生长的菌株。通过添加AFB1作为底物，对这14株芽孢杆菌进行复筛，在AFB1投料浓度为100 μg/kg的条件下，筛选得到两株降解率分别为83.20%和79.10%的菌株。本研究再次验证使用香豆素作为惟一碳氮源筛选AFB1生物降解菌株是一种简洁、快速和安全的方法[6]。经过16S rDNA序列测定和GenBank数据库序列比对分析，初步确定降解效率最高的芽孢杆菌CC6为巨大芽孢杆菌。相比其他研究中筛选得到的真菌和假单胞菌等菌株，芽孢杆菌在实际应用方面具有更大的优势。

本研究采用了酶联免疫法（ELISA）检测待测样品中AFB1的浓度。基于抗原抗体特异性反应建立起来的酶联免疫吸附分析法，具有特异性强、分析时间短的特点，而且其灵敏度与薄层层析法或高效液相色谱法相当或更高，发酵液提取均可在48孔板中完成，操作方便，提取后即可直接测定，不需要净化过程，一次可测定大量样本。

与国内其他AFB1生物降解菌筛选的研究相比，在菌株的培养方面首次提出了48孔长方形深孔板培养的方法。48孔长方形深孔板每孔的体积为5 mL，选择的装量为1 mL，与常用的96孔正方形深孔板相比，48孔板装量更大，振荡培养时更容易形成湍流，可以保證菌株生长过程获得充足的氧气，此时菌体生长和产物合成的变化趋势均与摇瓶培养过程非常相似。通过48孔板培养的方式，可以明显提高初筛与复筛的效率，培养基消耗也少，具有环保、高效、便捷的优点。

参考文献：

[1] 王 玉，陈现伟.生物降解花生粕中黄曲霉毒素B1的研究[J].饲料研究，2012（1）：80-81.

[2] 叶雪珠，王小骊，赵燕申，等.黄曲霉毒素B1检测方法的分析[J].食品与发酵工业，2003，29（10）：90-92.

[3] 孙丰芹，金青哲，王兴国，等.黄曲霉毒素B1的生物脱毒研究进展[J].粮油食品科技，2011，19（1）：39-41.

[4] GALVANO F，PIVA A，RITIENI A，et al. Dietary strategies to counteract the effects of mycotoxins：A review[J]. Journal of Food Protection，2001，64（1）：120-131.

[5] 萨姆布鲁克 J，拉赛尔D W.分子克隆手册[M].黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等.译.第3版.北京：科学出版社，2004.

[6] 李俊霞，梁志宏，关 舒，等.黄曲霉毒素B1降解菌株的筛选及鉴定[J].中国农业科学，2008，41（5）：1459-1463.