糖皮质激素受体与炎症反应

刘瑜 杨翔 万文辉

糖皮质激素受体与炎症反应

刘瑜 杨翔 万文辉

糖皮质激素(glucocorticoid,GC)是由肾上腺皮质束状带分泌的一类甾体激素,具有调节糖、脂、蛋白质合成与代谢,抑制免疫应答，抗炎、抗应激等重要作用。目前临床上广泛使用GC治疗炎症和免疫性疾病,如类风湿性关节炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、炎症性肠病、器官移植后等[1]。GC在体内的作用主要是通过糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)介导的。GR属于核受体超家族成员,其本质是配体依赖的转录因子,活化后的GR在细胞核内通过与DNA上的反应元件直接结合或作用于其他转录因子来促进或抑制靶基因转录,后者通过阻断炎症和免疫反应过程中相关靶基因的转录,抑制炎性细胞因子表达,在抗炎、调节免疫中具有重要作用[2]。临床中GC治疗存在许多不良反应,如高血压、糖代谢异常、骨质疏松等[3-4]。因此,深入了解GR及其对靶基因的调控机制,尤其是转录抑制机制,将为改善GC治疗效果,减少其不良反应提供新的思路。

1 GR概述

1.1 GR的基本结构 GR广泛表达于人体组织细胞中,具有核受体的典型结构(图1):(1)N端的转录激活域1(activation function 1, AF1),此区保守程度较低,具有非配体依赖的转录调节功能,也是GR翻译后修饰的主要部位;(2)高度保守的DNA结合域(DNA binding domain, DBD),该区含有2个锌指结构,能够特异地与靶基因上的GC反应元件(glucocorticoid response element, GRE)结合;(3)铰链区(hinge);(4)高度可变的配体结合域(ligand binding domain, LBD),除与特异配体结合外,此区还在受体的二聚化、亚细胞定位、辅调节因子的结合等中具有重要作用;(5)转录激活域2(activation function 2, AF2),具有配体依赖的转录调节功能[5-7]。

图1 GR基本结构

1.2 GR的分类 GR基因位于染色体5q31-q32,含有9个外显子,全长大约80 kb。根据对第9个外显子mRNA剪切方式的不同,产生α、β 2种异构体。在mRNA 水平上,GRα和GRβ都包含第1～8外显子,不同之处为GRα包含9α外显子,GRβ包含9β外显子。GRα在几乎所有组织和细胞中均有表达,其含量也远远超过GRβ,因此GC的作用主要是通过GRα介导的。GRβ主要位于细胞核内,其生理作用还不明确。GRβ不能与GC结合但可以和DNA结合,从而干扰GRα与DNA的结合,因此GRβ可能是内源性的GRα抑制剂,其过量表达可导致GC抵抗。选择性的表达GRβ还能够独立调节某些基因转录,说明其还具有一定的生理功能。此外,还有另外3种GR异构体GRγ、GR-A、GR-P被报道,其作用不明确,可能与GC抵抗有关[8-10]。

根据翻译起始位点的不同,GRα还存在8个亚型:GRα-A、GRα-B、GRα-C1、GRα-C2、GRα-C3、GRα-D1、GRα-D2、GRα-D3。同样的,GRβ分为GRβ-A、GRβ-B、GRβ-C1、GRβ-C2、GRβ-C3、GRβ-D1、GRβ-D2、GRβ-D3 8种亚型。不同亚型的存在可以部分解释为何GR能发挥多种生理及药理作用[5]。

1.3 GR的一般功能 正常生理条件下GR位于细胞浆内,与热休克蛋白(heat shock protein, HSP)复合体结合而处于失活状态,一旦与激素结合，则受体构型发生改变,与HSP复合体解离被激活,活化后的受体移位至细胞核内,通过以下方式调节靶基因转录:(1)直接与靶基因中的GRE结合;(2)与其他转录因子相互作用,改变其对靶基因的调节;(3)直接与DNA结合并与邻近的转录因子作用,即所谓的混合调节[5]。GRE是位于靶基因启动子或增强子的一段特异性核苷酸序列,能与GR特异性结合并介导GR的转录调节活性[11]。一般情况下,活化的GR与GRE结合后募集细胞核内的辅激活因子(co-activator)而促进靶基因转录。辅激活因子是细胞核内的一大类蛋白质,具有组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)活性,多以复合物形成存在,如SRC/p160蛋白家族和CBP/p300家族等。辅激活因子转录激活的机制主要有:(1)通过组蛋白乙酰化促进DNA与组蛋白分离,使DNA更易于接近转录因子;(2)通过蛋白质之间的相互作用,作为转录因子和基本转录复合物之间的桥梁激活转录[12]。GR与GRE结合后还能募集细胞核内的辅抑制因子(co-repressor)而抑制靶基因转录,这种GRE称为负性GRE(negative GRE, nGRE)[13]。同样,辅抑制因子也是细胞核内一大类蛋白质复合物,因具有组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)活性,能使组蛋白去乙酰化,增强组蛋白与DNA的结合,使染色质重趋紧密而不利于转录,如NCoR、SMRT蛋白家族等,此种作用与临床GC治疗不良反应的产生有关,如抑制骨钙蛋白的产生可导致骨质疏松[14]。GR还能通过作用于其他转录因子而间接阻断靶基因的转录,如与核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、活化蛋白-1(activator protein-1, AP-1)作用，抑制它们在炎症反应过程中对促炎靶基因的转录,包括细胞因子、趋化因子、黏附分子、炎症性酶和受体等,被称为反式抑制作用(transrepression),这是GC发挥抗炎作用的主要机制[15-16]。

2 GR与抗炎作用

2.1 反式抑制作用 天然免疫是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线,当病原体侵入机体后,通过天然免疫细胞(树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等)的模式识别受体(pattern recognition receptor, RRR)识别入侵的病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP),通过复杂的细胞内信号转导通路,最终导致细胞核内信号依赖的转录因子如NF-κB、AP-1等的激活。活化的转录因子与辅激活因子相结合,共同作用于靶基因的启动子或增强子,促进炎性因子的生成,参与机体的免疫反应,并最终激活机体的获得性免疫[17]。

NF-κB是炎症信号转导通路中一个重要的转录因子,人体内最常见的NF-κB是p65与p50组成的异二聚体。在生理状态下,NF-κB和抑制蛋白(inhibitor of κB, IκB)形成复合体,以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受炎症刺激后,通过MAPK等信号转导通路导致IκB激酶复合体(IκB kinase, IKK)活化,使得IκB磷酸化而被降解,NF-κB游离并迅速移位到细胞核,诱导相关基因转录,包括:肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、趋化因子、黏附分子、集落刺激因子等[18]。GR通过以下机制抑制NF-κB的转录激活:(1)与p65亚单位结合,阻断NF-κB与靶基因的结合;(2)与GR反应蛋白-1(GR interaction protein-1, GRIP-1)结合,使得辅激活因子干扰素调节因子3(interferon regulatory transcription factor 3, IRF3)不能与p65亚单位结合;(3) 阻断正性转录延伸因子b(positive transcription elongation factor b, pTEFb)的募集，pTEFb可使转录过程中RNA聚合酶Ⅱ磷酸化而促进其转录延伸活性，GR通过阻断pTEFb抑制靶基因转录延长;(4)募集具有HDAC活性的辅抑制因子使得染色质致密卷曲而抑制靶基因转录;(5)与NF-κB竞争与辅激活因子CPB/p300结合,抑制转录起始;(6)与肿瘤抑制蛋白p53相互作用;(7)上调IκB表达,使NF-κB失活;(8)诱导丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MAPK phosphatase-1, MKP-1)的产生，使p38失活,阻遏MAPK信号转导通路,抑制IκB降解和NF-κB活化[19-20]。

AP-1属于碱性亮氨酸拉链转录因子,人体内AP-1以二聚体形式存在,最常见的为cJun-cFos异二聚体。环境应激、炎性因子等的刺激通过MAPK信号转导通路激活AP-1,活化的AP-1作用于靶基因中的佛波酯反应元件或cAMP反应元件,调控多种因子,如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等的表达[21]。GR抑制AP-1转录活性的作用机制与NF-κB类似:(1)直接与AP-1的c-Jun相互亚单位结合,阻断AP-1与靶基因的结合;(2)与靶基因上的GRE结合并与AP-1的c-Jun相互作用;(3)诱导MKP-1的产生，使得JNK失活,阻遏MAPK信号转导通路,降低AP-1转录活性[19-20]。

2.2 直接转录调控作用 GR活化后还能通过激活抗炎基因的转录而发挥抗炎作用,除了前述的ⅠκB、MKP-1外,还有膜联蛋白 A1(annexin A1, AnxA1)、血清白细胞蛋白酶抑制剂(secretory leukoprotease inhibitor, SLPI)、糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白(glucocorticoid-induced leucine zipper protein,GILZ)、IL-10、IL-1受体Ⅱ型、β肾上腺素能受体等[21]。

2.3 转录后水平调控作用 尽管GR的抗炎作用主要是在转录水平上进行的,但有研究发现,GR还可通过降低mRNA的稳定性来抑制炎症因子如COX-2、TNF、血管内皮生长因子、干扰素β、IL-1、IL-5、IL-6、诱导型一氧化氮合酶和一些趋化因子等的表达。这些因子的mRNA在3’非翻译区具有富含腺嘌呤/尿嘧啶的元件(adenylate/uridylate-rich elements, ARE),能够与ARE结合蛋白如锌指蛋白36(tristetraprolin, TTP)发生特异性结合。TTP能够降低mRNA的稳定性，促进mRNA降解。GR能上调TTP表达,减少上述炎性因子的产生，从而发挥抗炎作用[22-23]。

3 GR与促炎作用

研究表明,在不同的激素作用时间和机体免疫状态下,GC还可发挥不同的效应,例如在长期慢性病程中,GC主要发挥抗炎抗免疫作用,而在急性状态下,GC则能提高机体的免疫反应而具有促炎作用。例如GC能够加重迟发型过敏反应的外周免疫反应;急性应激中随着GC分泌增加,中枢神经系统内促炎因子IL-1β水平升高[24]。GC促炎机制还不清楚。研究发现,GR活化后能够与TNF-α协同促进NF-κB、信号转导和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)与Toll样受体2(Toll-like receptor 2, TLR2)启动子上的反应元件结合,上调TLR2表达。TLR2属于RRR,能够识别细菌细胞壁中的肽聚糖。TLR2激活后通过下游的信号转导通路,激活促炎转录因子,最终导致促炎细胞因子IL-6、IL-8等的分泌增加[25]。同样,GR活化后还能与IL-6家族成员——白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)协同上调天然免疫反应和急性期反应中多种基因的表达[26]。GR还能诱导核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)样受体(NOD-like receptor,NLR)家族成员NLR热蛋白结构域亚家族成员3(NLR pyrin domain-containing 3,NLRP3)的表达。NLRP3是巨噬细胞中炎症小体的核心成分,其表达上调后能够增加巨噬细胞对细胞外有害刺激信号的敏感性,NLRP3炎症小体活化本身还可导致caspase-1自身裂解和活化,促进IL-1β的表达和分泌,增强机体的免疫炎症反应[27]。此外,GR还能上调嘌呤受体P2Y2的表达。P2Y2受体属于G蛋白偶联受体,其表达上调后能够通过磷脂酶C和蛋白激酶C激活下游的信号通路,最终导致IL-6分泌增加[28]。因此,GR能够通过上调TLR2、NLRP3、P2Y2的表达及与TNF-α、LIF等协同而发挥促炎作用,增强机体的防御功能。

4 结语

综上所述,通过不同的GR信号转导机制,GC在体内的作用远较之前的认识复杂。在早期、急性期和生理状态(炎症前)下,通过对天然免疫的激活促使机体免疫系统对病原体发挥快速、有效的炎症反应,而在后期、慢性期及病理状态下(炎症后),通过抑制炎症因子的释放来避免过度的炎症反应。将来还需要对GR在不同组织中的促炎和抗炎效应进行研究,以帮助我们更好地利用GR不同效应设计更好的治疗策略。

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