新牧1号苜蓿两种抗逆相关启动子的功能分析

晁朝霞，任燕萍，钱进，姚正培，许磊，张桦*

(1.新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.江苏金色农业科技发展有限公司，江苏 盐城 224100；3.南京农业大学草业学院，江苏 南京 210095)

新牧1号苜蓿两种抗逆相关启动子的功能分析

晁朝霞1，任燕萍1，钱进2，姚正培1，许磊3，张桦1*

(1.新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.江苏金色农业科技发展有限公司，江苏 盐城 224100；3.南京农业大学草业学院，江苏 南京 210095)

前期已成功克隆了新牧1号苜蓿MvP5CS与MvNHX1基因和二者的启动子序列。在此基础上，本试验分别构建了含有Mvp5cs和Mvnhx1启动子的调控GUS报告基因的植物表达载体，并通过农杆菌介导法得到了含有Mvnhx1与Mvp5cs启动子的转基因烟草植株。PCR检测证明了两种启动子已稳定的整合到烟草基因组中；GUS组织染色证明两种启动子均具有启动基因表达的功能。通过测量GUS活性来探究两种不同的诱导型启动子在4种非生物胁迫下(干旱、盐、脱落酸、赤霉素)的表达活性。结果表明，1)Mvnhx1与Mvp5cs启动子均响应盐、脱落酸、赤霉素、干旱胁迫，与CaMV35S启动子相比，差异显著。2)Mvnhx1启动子在盐胁迫、脱落酸胁迫下所起诱导作用要优于Mvp5cs启动子。在48 h 100 mmol/L、150 mmol/L NaCl胁迫处理时，Mvnhx1启动子GUS活性分别是Mvp5cs启动子的2.03和3.23倍，差异显著。在25 μmol/L、 50 μmol/L ABA处理下，Mvnhx1启动子的活性整体高于另两种启动子，差异显著。3)Mvp5cs启动子在干旱胁迫、赤霉素胁迫所起诱导作用优于Mvnhx1启动子。干旱胁迫时，Mvp5cs启动子的GUS活性在36 h是同时间Mvnhx1启动子的2.22倍。70 μmol/L GA处理时，Mvp5cs启动子在36 h达到最大值，是同时间段Mvnhx1启动子的1.79倍。

启动子；Mvnhx1；Mvp5cs；遗传转化；非生物胁迫；GUS活性

启动子是一段位于结构基因5′端上游区的DNA序列，能够活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的相结合并具有转录起始的特异性[1]，在基因表达调控过程中起着重要作用。启动子按照作用方式和功能可以分为3种，组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子。组成型启动子在所有组织中都有表达，不具有时空特异性，表达量相对恒定，如目前在植物基因工程中广泛使用的如花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子[2-3]、玉米泛素基因Ubiquitin启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因NOS启动子等。组织特异性启动子可以使外源基因只在特殊的组织部位启动基因表达，已报道的组织特异型启动子有水稻(Oryzasativa)绿色组织特异表达基因的启动子PDX1[4]、大豆(Glycinemax)中的维管组织特异表达的蔗糖结合蛋白启动子GmSBP2[5]，但应用不够广泛。诱导型启动子在特定诱导的情况下启动基因表达，当诱导因素不存在时就不再开启基因表达，不会持续表达基因，这样可以减少物质和能量浪费，有效调控下游基因在特定的条件下表达。已报道的诱导型启动子有拟南芥(Arabidopsisthaliana)rd29A启动子[6]，毛白杨(Populustomentosa)TIR启动子[7]等。组成型启动子容易造成大量代谢产物的积累，增加植物的负荷，阻碍了植物的正常生长[8-11]。因此，在植物基因工程中，寻找表达特异性更加明显的组织特异型启动子和诱导型启动子来替代组成型启动子显得尤为重要。

Na+/H+逆向转运蛋白合成基因(Na+/H+antiporter gene，NHX1)在高盐环境下，将Na+逆浓度梯度转运到液泡膜中，减少细胞质中Na+浓度。研究表明，将拟南芥AtNHX1基因转入玉米(Zeamays)[12]、花生(Arachishypogaea)[13]中可以有效缓解盐胁迫的损伤，提高作物的耐盐性。Δ′—二氢吡咯—5—羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS)基因是植物脯氨酸生物合成中的限速酶，制约着植物体内脯氨酸的积累速度。脯氨酸能维持稳定渗透压平衡，阻止水分散失。研究表明，野生大豆P5CS基因可以调控内源脯氨酸合成，在干旱和盐环境等逆境下大量表达，显著提高植株的抗逆能力[14]。大量游离脯氨酸的积聚为植株从逆境状态恢复至常态提供了能量和还原剂，有效地提高了植物的抗逆能力[15-16]。

本实验室前期已成功从新牧1号苜蓿中克隆了MvP5CS基因(GenBank登录号为EU371644)和MvNHX1基因(GenBank登录号为EU375310)[17]及二者的启动子序列。其中MvP5CS基因启动子Mvp5cs1429 bp，GenBank登录号：KU963587；MvNHX1基因启动子Mvnhx1 1655 bp，GenBank登录号：KU987821。已证明这2个基因在干旱和盐的胁迫下表达上调，经转基因功能分析验证为抗旱耐盐相关基因[18]，但未研究这2个基因启动子的功能特点。本试验构建Mvp5cs启动子和Mvnhx1启动子调控GUS基因表达的植物表达载体；利用农杆菌介导法，于2015年7月份左右获得转基因烟草(Nicotianatabacum)；在2016年1月份时通过干旱和不同浓度梯度的盐胁迫、脱落酸胁迫、赤霉素胁迫分析GUS基因的表达情况，研究这两种启动子在不同胁迫处理下的调控外源基因表达特征，从而明确两种启动子的作用特点，对研究植物抗逆分子调控机制具有重要的理论价值，在抗逆植物基因工程研究中有较好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料和主要试剂

根瘤农杆菌EHA105菌株、植物表达载体pCAMBIA1304、本赛姆氏烟草由本实验室留存。TaKaRa T4 Ligase，限制性内切酶购自宝信生物科技有限公司；凝胶回收试剂盒，pEASY-T1 simple Cloning Kit，DH5α感受态，DNA Marker购自北京全式金生物公司。质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司。抗生素购自Biosharp。引物由华大基因合成。其他试剂为国产分析纯。

图1 植物表达载体构建 Fig.1 Plant expression vector schematicA：pCAMBIA1304质粒结构简图 pCAMBIA1304 plasmid structure diagram; B：pMvp5cs-1304质粒简图 pMvp5cs-1304 plasmid structure diagram; C：pMvnhx1-1304质粒简图 pMvnhx1-1304 plasmid structure diagram; SacⅠ、NcoⅠ：酶切位点 Restriction enzyme cutting site; LB：左边界 T-border (L); RB：右边界 T-border (R).

1.2 实验方法

1.2.1Mvp5cs与Mvnhx1启动子表达载体的构建 分别回收经过NcoⅠ和SacⅠ双酶切的Mvp5cs与Mvnhx1启动子片段，同时回收NcoⅠ和SacⅠ双酶切切除35S启动子的pCAMBIA-1304载体片段。T4 Ligase连接启动子片段与载体片段，分别获得与GUS基因的融合表达载体pMvp5cs-1304和pMvnhx1-1304(图1)。

1.2.2 农杆菌转化烟草 采取冻融法将pMvp5cs-1304表达载体质粒、pMvnhx1-1304表达载体质粒、pCAMBIA1304表达载体质粒转入农杆菌EHA105菌株中。

分别将3种重组质粒农杆菌在发根农杆菌培养基(Agrobacterium rhizogene medium，YEB)液体培养基[卡那霉素(kanamycin，Kan)50 mg/mL，利福平(rifampicin, Rif)50 mg/mL]中培养至OD600=0.6，4000 r/min离心10 min，弃上清，MS(MS culture medium)液体培养基中悬浮至OD600=0.6。选取幼嫩的非转基因烟草叶片去除边缘及叶脉部分，剪成0.5 cm×0.5 cm大小，置于MS菌液中浸染10 min，用滤纸吸干菌液，叶片背面朝上，平放于共生培养基[MS固体培养基+萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)0.1 mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA) 1 mg/L)]上；暗培养2 d后移至筛选培养基[MS固体培养基+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L+Kan 100 mg/L+头孢霉素(cefotaxime sodium，Cef)500 mg/L]中；4周左右将烟草不定芽移至生根培养基(1/2MS固体培养基+NAA 0.1 mg/L+Cef 500 mg/L)中[19-21]；待生根完全后炼苗，移栽到灭菌土中。

1.2.3 烟草再生植株的分子鉴定 采用CTAB一步法提取烟草再生植株与野生烟草基因组DNA，通过HPT引物(F：5′-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3′，R：5′-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3′)、GUS基因引物(F：5′-AGACTATCCCGCCGGGAATGG-3′，R：5′-GCGGTGATACATATCCAGCCA-3′)与启动子引物(pMvp5csF:5′-ATCGAGCTCCCTTTCAAGAGAAGCCCATT-3′，R：5′-TCACCATGGGCAAGAGACAGTTCACGTA-3′；pMvnx1 F:5′-TACGACGGCAGTGCAGCTTGCATGC-3′，R：5′-TGGCTCGAGCTTAGCATTAGTCAGT-3′)共3对引物进行PCR检测。

1.2.4 GUS组织染色 分别剪取3种鉴定成功的转基因烟草叶片、根、茎、花，丙酮固定30 min，冲洗后加入GUS染色液，抽真空处理后37 ℃染色12 h，75%乙醇脱色至烟草组织底色为无色，拍照[22]。

1.2.5 胁迫处理和GUS活性的检测 分别剪取3种鉴定成功的转基因烟草叶片进行以下浓度的胁迫处理，1)NaCl：50，100，150 mmol/L，剪取3种植株叶片分别浸入以上盐溶液中；2)脱落酸：10，25，50 μmol/L，均匀喷洒在离体烟草叶片上；3)赤霉素：30，50，70 μmol/L；均匀喷洒在离体烟草叶片上；4)干旱胁迫：剪取离体烟草叶片置于室温干燥处进行胁迫。以上4种胁迫分别处理0，4，12，24，36，48 h，其中NaCl胁迫和干旱胁迫增加复水1和4 h两个时间点，每个时间点分别同时采取3种转基因烟草叶片，进行3个重复检测。GUS荧光检测具体方法参见Jefferson[22]，检测到的荧光值除以总蛋白浓度得到GUS的相对活性[23]。

1.3 数据处理

利用SPSS软件对数据进行P<0.05水平上的方差分析，并用Excel 2013作图。

2 结果与分析

图2 表达载体双酶切验证图Fig.2 Double digestion of expression vector M：4 kb DNA分子量 4 kb DNA marker; A：pMvnhx1-1304表达载体质粒双酶切验证 Double digestion of pMvnhx1-1304 plasmid; 1：pMvnhx1-1304表达载体质粒双酶切产物 Product of double digestion of pMvnhx1-1304 plasmid. B：pMvp5cs-1304表达载体质粒双酶切验证 Double digestion of pMvp5cs-1304 plasmid; 1：pMvp5cs-1304表达载体质粒双酶切产物 Product of double digestion of pMvp5cs-1304 plasmid.

2.1 表达载体的构建

分别回收经过NcoⅠ和SacⅠ双酶切回收的Mvnhx1启动子片段、Mvp5cs启动子片段、pCAMBIA1304载体片段，用T4 Ligase将Mvnhx1、Mvp5cs启动子片段分别和载体片段连接。如图2所示，经过酶切验证后，分别得到1655和1429 bp的条带，与预期结果相同。

2.2 转基因烟草再生植株的获得

如图3所示，烟草外植体(图3A)在筛选培养基上培养4周左右，长出愈伤组织，并分化出抗性再生芽(图3B)。再生芽长到3～4 cm时切下移至生根培养基，4周左右生根(图3C)。待根系生长健壮后，炼苗，移至灭菌花土中(图3D)。

图3 烟草抗性芽的筛选及再生植株的获得Fig.3 Selection of tobacco resistant bud and regeneration tobacco plants A：共培养叶盘 Col-culture leaves; B：再生芽 Regenerate bud; C:生根植株根系 The root of regenerated plant; D：烟草再生植株Tobacco regenerated plant.

2.3 烟草再生植株的鉴定

通过启动子引物、GUS基因引物和HPT引物进行PCR检测，3对引物均扩增出目的条带，鉴定为阳性植株。Mvnhx1启动子目的片段为1665 bp，Mvp5cs启动子目的片段为1429 bp；GUS基因目的片段为1081 bp；HPT筛选标记基因目的片段为812 bp。如图4所示，转Mvnhx1启动子得到3株阳性植株，转Mvp5cs启动子得到2株阳性烟草植株。

2.4 GUS组织染色

利用GUS组织染色法对pMvnhx1：：GUS、pMvp5cs：：GUS、CaMV35S：：GUS烟草植株叶片、根、茎、花进行染色。如图5所示，3种烟草各器官组织呈现不同程度的蓝色，其中叶和花颜色最明显，根和茎有轻微的蓝色斑点。初步说明3种启动子具有启动子活性，能够驱使下游GUS基因的表达，组织特异性不明显。

2.5 GUS活性的检测

干旱胁迫时，如图6所示，Mvp5cs启动子的GUS活性在36 h达到最高，是同时间Mvnhx1启动子的2.22倍。复水后Mvnhx1启动子与Mvp5cs启动子的GUS活性均下降，表明2种启动子在没有干旱胁迫时不能有效启动下游基因表达。CaMV35S启动子的GUS活性变化差异不显著，Mvnhx1启动子、Mvp5cs启动子与CaMV35S启动子相比差异显著，且Mvp5cs启动子干旱胁迫的响应与Mvnhx1启动子相比更明显。

图4 烟草再生植株的鉴定Fig.4 Identification of regeneration tobacco plants M1：4 kb DNA分子量。 4 kb DNA marker; M2：2 kb DNA分子量。 2 kb DNA marker;1～15：pMvnhx1：：GUS转基因植株的鉴定 Identification of transgenic tobacco plants of pMvnhx1：：GUS; 1～5：Mvnhx1启动子引物PCR验证 Mvnhx1 promoter primers PCR; 1～3：转基因植株 Transgenic tobacco plants; 4：非转基因烟草 Non-transgenic tobacco; 5：pMvnhx1：：GUS质粒 Plasmid of pMvnhx1：：GUS; 6～10：GUS基因引物PCR验证 GUS gene primers PCR; 6～8：转基因植株 Transgenic tobacco plants; 9：非转基因烟草 Non-transgenic tobacco; 10：pMvnhx1：：GUS质粒 Plasmid of pMvnhx1：：GUS; 11～15：HPT引物PCR验证 HPT gene primers PCR; 11～13：转基因植株 Transgenic tobacco plants; 14：非转基因烟草 Non-transgenic tobacco; 15：pMvnhx1：：GUS质粒 Plasmid of pMvnhx1：：GUS;16～27：pMvp5cs：：GUS转基因植株的鉴定 Identification of transgenic tobacco plants of pMvp5cs：：GUS; 16～19：Mvp5cs启动子引物PCR验证 Mvp5cs primers PCR; 16～17：转基因植株 Transgenic tobacco plants; 18：非转基因烟草 Non-transgenic tobacco; 19：pMvp5cs：：GUS质粒 Plasmid of pMvp5cs：：GUS; 20～23：GUS引物PCR验证 GUS gene primers PCR; 20～21：转基因植株 Transgenic tobacco plants; 22：非转基因烟草 Non-transgenic tobacco; 23：pMvp5cs：：GUS质粒 Plasmid of pMvp5cs：：GUS; 24～27：HPT引物PCR验证 HPT gene primers PCR; 24～25：转基因植株 Transgenic tobacco plants; 26：非转基因烟草 Non-transgenic tobacco; 27: pMvp5cs：：GUS质粒 Plasmid of pMvp5cs：：GUS.

图5 GUS组织染色效果Fig.5 GUS tissue staining effect 从上到下：叶片，根，茎横切面，花。 Top-to-bottom: leaf, root, stem cross section, flower; A： CaMV35S：：GUS烟草 Tobacco of CaMV35S：：GUS; B： pMvnhx1：：GUS烟草 Tobacco leaves pMvnhx1：：GUS; C： pMvp5cs：：GUS烟草 Tobacco leaves pMvp5cs：：GUS.

图6 干旱胁迫时GUS活性检测 Fig.6 GUS activity detection under drought stress 不同小写字母者表示所有数据在P<0.05 水平上差异显著。Different letters mean all data significantly different at the P<0.05 probability level. 复1：复水1 h。 Rewater 1 h; 复4：复水4 h。 Rewater 4 h.下同The same below.

3种盐浓度胁迫时，如图7所示，在50 mmol/L盐浓度处理下，3种启动子的GUS活性差别不显著。随着盐浓度的提高，CaMV35S启动子GUS活性变化不大，差异不显著；Mvp5cs启动子与Mvnhx1启动子GUS活性明显提高，两种启动子与CaMV35S启动子相比较差异性显著，Mvnhx1启动子GUS活性明显高于Mvp5cs启动子。在48 h， 100和150 mmol/L NaCl处理时，Mvnhx1启动子GUS活性分别是Mvp5cs启动子的2.03和3.23倍，差异显著。复水处理后，Mvp5cs启动子与Mvnhx1启动子活性均明显下降，表明2种启动子在没有盐胁迫后不能有效启动下游基因表达。比较2种启动子，Mvp5cs启动子与Mvnhx1启动子在盐胁迫下均能显著提高下游基因的表达，Mvnhx1启动子响应能力更强。

图7 盐胁迫时GUS活性检测Fig.7 GUS activity detection under NaCl stress

脱落酸3种浓度胁迫时，如图8所示，CaMV35S启动子GUS活性整体变化不大，差异不显著。Mvp5cs启动子与CaMV35S启动子相比在低浓度脱落酸处理下差异不显著，但是在50 μmol/L ABA处理时，在24和36 h的GUS活性是CaMV35S启动子的3.11和2.08倍。Mvnhx1启动子活性随着胁迫浓度的升高逐渐提高，25和50 μmol/L ABA处理时，36 h达到峰值，48 h时开始下降，其活性整体高于另外两种启动子，差异显著。说明Mvp5cs启动子与Mvnhx1启动子均能响应脱落酸胁迫，Mvnhx1启动子在较低浓度就可以启动下游基因表达，所以对ABA的响应更显著。

图8 脱落酸胁迫时GUS活性检测 Fig.8 GUS activity detection under ABA(abscisic acid)stress

图9 赤霉素胁迫时GUS活性检测Fig.9 GUS activity detection under GA(gibberellin) stress

在赤霉素胁迫下，如图9所示，30 μmol/L处理时，CaMV35S启动子GUS活性略有升高，但整体差异不明显；Mvnhx1与Mvp5cs启动子稍高于CaMV35S启动子，差异不显著。50 μmol/L，Mvp5cs启动子与Mvnhx1启动子活性明显升高，呈递增趋势，与CaMV35S启动子相比差异显著。70 μmol/L处理时，Mvp5cs启动子的GUS活性较50 μmol/L升幅更大，在36 h达到最大值，是同时间段Mvnhx1启动子的1.79倍；Mvnhx1启动子活性虽呈上升趋势，但比50 μmol/L GA处理有所下降。在50，70 μmol/L GA处理时，Mvp5cs启动子、Mvnhx1启动子与CaMV35S启动子差异显著。说明赤霉素胁迫下，Mvp5cs启动子、Mvnhx1启动子与CaMV35S启动子差异显著，均能响应赤霉素胁迫，Mvp5cs启动子比Mvnhx1启动子响应更强烈。

表1 Mvnhx1启动子序列顺式作用元件分析Table 1 Cis-acting regulatory elements analysis of Mvnhx1 promoter sequences

注：“+1”位置处为转录起始位点，起点后面的3′端下游序列依次为+2，+3，……，起点前面的5′端上游序列依次为-1，-2，……；下同。

Note: Position“+1”is the transcription start site, and the downstream sequence of the 3′ end is followed by +2， +3，……, from the beginning of the 5′ end of the upstream sequence as followed by -1, -2，……； The same below.

通过启动子顺式作用元件预测网站PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)进行预测分析，结果如表1、表2所示。Mvnhx1与Mvp5cs启动子都属于RNA聚合酶Ⅱ型启动子，2种启动子都具有TATA box核心启动子元件CAAT box、GATA box等植物启动子中存在的通用启动子元件。Mvnhx1启动子含有逆境响应元件TC-rich-repeats(ATTTTCTTCA)2个、干旱和盐响应元件MYB2CONSENSUSAT(YAACKG)3个、盐响应元件GT1CONSENSUS(GAAAAA)12个、干旱、脱落酸响应元件MYCCONSENSUSAT(CANNTG)9个、脱水响应元件CBFHV(RYCGAC)2个；ABA响应元件RY-repeats(YACT)1个、DPBFCOREDCDC3(ACACNNG)2个、ABRE(ACGTG)1个；赤霉素响应元件PYR(TTTTTTCC)1个、GAREAT(TAACAAR)1个；植物防御响应元件WBOXNTERF3(TGACY)2个及其他响应水杨酸、生长素等响应元件。Mvp5cs启动子具有干旱响应元件MBS 1个、干旱和脱落酸响应元件MYB(WAACCA)3个、干旱逆境响应元件MYB2AT(TAACTG)1个、MYBCORE(CNGTTR)3个、 MYCCONSENSUSAT(CANNTG)5个、低温干旱响应元件LTRE(CCGAC)2个；盐响应元件GT1CONSENSUS(GAAAAA)5个；赤霉素响应元件PYR(TTTTTTCC)2个、GARE-motif(GATAGGG)1个、DPBFCOREDCDC3(ACACNNG)2个；脱落酸响应元件ABRE(ACGTG)1个；植物防御响应元件WBOXATNPR1(TTGAC)3个。

表2 Mvp5cs启动子序列顺式作用元件分析Table 2 Cis-acting regulatory elements analysis of Mvp5cs promoter sequences

通过比较分析得知，Mvnhx1启动子比Mvp5cs启动子盐胁迫相关的响应元件GT1CONSENSUS上多出7个，MYB2CONSENSUSAT元件多出2个；脱落酸响应元件上MYCCONSENSUSAT多出4个、RY-repeats 1个。Mvp5cs启动子比Mvnhx1启动子在干旱响应元件MYB上多出3个、LTRE多出2个；赤霉素响应元件上PYR多出1个。

3 讨论

本课题组前期已通过花粉管通道法分别获得高代稳定遗传的转MvNHX1基因和转MvP5CS基因棉花(Gossypium)，经过一系列农艺生理指标和生理生化指标检测，证明转MvNHX1基因棉花在耐盐性上优于转MvP5CS基因棉花，转MvP5CS基因棉花在抗旱性方面优于转MvNHX1基因棉花[24]。说明了MvNHX1基因与MvP5CS基因是抗旱耐盐相关的基因，但在抗旱和耐盐性上仍有差异。通过本试验不同种类、不同时间、浓度梯度的胁迫可知， 组成型启动子CaMV35S活性在正常情况下与Mvnhx1启动子、Mvp5cs启动子差异不显著，4种胁迫处理后整体的GUS活性要低于Mvnhx1启动子与Mvp5cs启动子。Mvnhx1启动子在盐胁迫、脱落酸胁迫下所起诱导作用要优于Mvp5cs启动子。Mvp5cs启动子在干旱胁迫、赤霉素胁迫所起诱导作用优于Mvnhx1启动子。此结果和2个启动子间顺式作用元件的差别有着直接的联系。

部分研究表明WRKY71OS元件可能有抑制赤霉素通道响应的作用，可分别通过以下3种机制实现：与GARE竞争相结合的元件；与后面序列TGAC core结合；与上游的W-BOX结合。Mvnhx1启动子含有WRKY71OS元件，这个元件有可能是两个启动子在赤霉素胁迫上有差异的原因之一。但WRKY71OS元件与其他启动子元件结合产生了新的调控应答也未可知。一些关于ABRE元件的报道发现此元件需要与多个重复或与其他元件相结合才可以响应ABA信号，两个启动子都只含有一个ABRE元件，Mvnhx1启动子在脱落酸响应上要优于Mvp5cs启动子，推测MYCCONSENSUSAT、RY-repeats两个相关元件起主要作用。以上顺式作用元件种类和数量的差别可能是导致2种启动子在不同胁迫下产生不同应答反应的原因之一，元件的差异也可能导致了不同的调控应答网络，但还需要进一步试验探索。2个启动子上的不同作用元件具体在植物应答外界反应中所起的作用还需要进一步研究探讨[17,25-27]。

4 结论

启动子调控了基因的表达，本试验通过对两种启动子的转基因植株进行胁迫下的GUS活性检测，初步检测了两种启动子的功能，证明了Mvnhx1启动子与Mvp5cs启动子是干旱、盐诱导型启动子；但在干旱和盐诱导后启动子基因表达存在差异，两种启动子之间功能的差异与其自身的顺式作用元件有着密切的联系。在本研究的基础上，下一步可以具体研究这两种启动子所含调控元件的作用，进一步揭示启动子各关键调控元件的作用，从而有助于更好的阐明植物抗逆分子机制。

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Functional analysis of two stress-related promoters in Medicago varia cultivar Xinmu No.1

CHAO Zhao-Xia1, REN Yan-Ping1, QIAN Jin2, YAO Zheng-Pei1, XU Lei3, ZHANG Hua1*

1.CollegeofAgriculture,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China; 2.JiangsuGoldenAgriculturalScienceandTechnologyDevelopmentCo.,Ltd,Yancheng224100,China; 3.PratacultureInstitute,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

MvP5CSandMvNHX1 genes of theMedicagovariacultivar Xinmu No.1 and their promoter sequences have been successfully cloned in previous work. Based on this research, in this study two plant expression vectors, each containingMvp5csandMvnhx1 promoters with aGUSgene as the reporter, were constructed and two tobacco transgenic plants with the promoter obtained by Agrobacterium-mediated method. PCR analysis showed that the two promoters had been stably integrated into the tobacco genome and GUS-staining proved that they have the function of activating gene expression. We explored this function by measuring GUS activity under four different abiotic stresses: drought, salinity, abscisic acid (ABA) and gibberellin (GA). The results showed thatMvnhx1 andMvp5csresponded to the four stresses and had significant differences from theCaMV35Spromoter. TheMvnhx1 promoter was superior toMvp5csunder salt and ABA stress. After 48 h treatments of 100 and 150 mmol/L NaCl stress, the GUS activity ofMvnhx1 was 2.03 times and 3.23 times that ofMvp5cs. Under treatments of 25 and 50 μmol/L ABA stress,Mvnhx1 activity was significantly higher than the other two promoters.Mvp5cswas superior toMvnhx1 under drought and GA stress. The GUS activity of theMvp5cswas 2.22 times that ofMvnhx1 after 36 h treatment of drought stress. TheMvp5cspromoter reached its maximum value, which was 1.79 times that ofMvnhx1, after 36 h treatment with 70 μmol/L GA stress.

promoter；Mvnhx1；Mvp5cs；genetic transformation；abiotic stress；GUS activity

10.11686/cyxb2016071

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-02；改回日期：2016-04-07

新疆维吾尔自治区自然科学基金(项目编号：2014211B017)资助。

晁朝霞(1989-)，女，山东菏泽人，在读硕士。E-mail:xiangyin.cool@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail:hazelzhang@163.com

晁朝霞， 任燕萍， 钱进， 姚正培， 许磊， 张桦. 新牧1号苜蓿两种抗逆相关启动子的功能分析. 草业学报, 2017, 26(1): 131-141.

CHAO Zhao-Xia, REN Yan-Ping, QIAN Jin, YAO Zheng-Pei, XU Lei, ZHANG Hua. Functional analysis of two stress-related promoters inMedicagovariacultivar Xinmu No.1. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(1): 131-141.