BACTEC MGIT 960培养管内浑浊生长抗酸杆菌的分析

杨翰 党丽云 崔晓利 尤震宇 谈小文 刘元

·短篇论著·

BACTEC MGIT 960培养管内浑浊生长抗酸杆菌的分析

杨翰 党丽云 崔晓利 尤震宇 谈小文 刘元

收集2012年11月至2015年12月西安市胸科医院分枝杆菌培养阳性标本中， 在BACTEC MGIT 960培养管内浑浊生长且萋-尼抗酸染色阳性的标本58份(来自58例患者)。通过萋-尼染色、对硝基苯甲酸(PNB)鉴别培养、MPB64蛋白免疫胶体金法检测、结核分枝杆菌(MTB)及非结核分枝杆菌(NTM)特异性基因片段PCR-荧光探针法检测、DNA 微阵列芯片法菌种鉴定及耐药基因检测等方法对这58例标本进行菌种鉴定，并回顾58例患者的相关标本的MTB及NTM特异性基因片段PCR-荧光探针法的检测结果。结果发现，58份标本浑浊生长抗酸杆菌呈分散逗点、杆状生长；其中56份标本有NTM单独生长，1份为MTB单独生长，1份为NTM和MTB混合生长。58例患者中有5例存在NTM与MTB混合感染，且MTB的利福平和异烟肼耐药基因均为野生型。由此可初步判定浑浊生长的培养管需排除管内NTM生长后，才能判断MTB单独感染。

分枝杆菌，结核； 分枝杆菌感染； 诊断，鉴别

BACTEC MGIT 960是目前应用最广泛的液体培养基全自动分枝杆菌检测仪器。其进行分枝杆菌培养时偶尔会出现培养管内抗酸杆菌浑浊生长的情况。对上述现象进行深入了解并分析其成分，笔者收集2012年11月至2015年12月西安市胸科医院分枝杆菌培养阳性并在BACTEC MGIT 960培养管内浑浊生长且萋-尼抗酸染色阳性的标本，对生长物进行抗酸染色观察其形态，并鉴定分析菌液成分，现报告如下。

材料和方法

1.材料：收集2012年11月至2015年12月西安市胸科医院分枝杆菌培养阳性标本7389份，选取其中在培养管内浑浊生长且萋-尼抗酸染色阳性标本58份，来自58例患者。

2.仪器和试剂：抗酸染色试剂盒(批号：412091；珠海贝索生物技术有限公司)、结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(批号：TB140701、TB150902；杭州创新生物检控技术有限公司)、分枝杆菌核酸检测试剂盒(批号：0108141504；北京博奥生物科技有限公司)、结核分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(批号：0106151512；北京博奥生物科技有限公司)、结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒(批号：01112151606；北京博奥生物科技有限公司)、ABI7300荧光定量PCR仪(美国应用生物公司)、杂交仪BioMixerTMⅡ(北京博奥生物科技有限公司)、芯片扫描仪LuxScan-10K/B(北京博奥生物科技有限公司)。

3.萋-尼氏抗酸染色：取0.1 ml菌液涂片，并加入1滴小牛血浆，待干燥后应用紫外线消毒2 h，固定进行萋-尼抗酸染色[1]。

4. 对硝基苯甲酸(PNB)鉴别培养[2]：取0.2 ml菌液接种在PNB鉴别培养基斜面上，37 ℃恒温箱内放置4周观察结果，结果判读：有抗酸菌生长则该抗酸菌为非结核分枝杆菌(NTM)；不生长则该抗酸菌为结核分枝杆菌(MTB)。

5. MPB64 蛋白免疫胶体金法检测[3]：取100 μl液体培养基菌悬液加入到试剂检测孔中，15 min后观察，1 h内判定结果。结果判读：检测线和质控线均出现紫红色条带为阳性；质控线出现，但检测线未出现紫红色条带者为阴性；质控线未出者表示试剂存在问题，须重新检测。

6. MTB及NTM特异性基因片段PCR-荧光探针法检测：取1 ml菌液加入1.5 ml离心管中，以离心半径9.7 cm，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 ml生理盐水涡旋震荡后，再以离心半径9.7 cm，12 000 r/min 离心5 min，弃上清。向沉淀中加入50 μl核酸提取液并转入带磁珠的核酸提取管中，提取仪快速震荡10 min，然后95 ℃水浴5 min。取2 μl 提取好的核酸溶液加入18 μl PCR扩增试剂中进行扩增：37 ℃、300 s(1个循环)，94 ℃、180 s(1个循环)，94 ℃、15 s(40个循环)，60 ℃、30 s(40个循环)，50 ℃、10 s(1个循环)；荧光采集点选择60 ℃、30 s，同时检测FAM通道和HEX通道。结果判读：样本曲线与阈值线交点的横坐标读数循环阈值(Ct值)<40的样本为阳性，Ct值>40或无数值的为阴性，检测结果的解释见表1。

表1 MTB及NTM特异性基因片段PCR-荧光探针法检测结果解释

7.NTM的菌种鉴定[4-6]：采用DNA微阵列芯片法。杂交反应：按每管9 μl分装，每管加入6 μl相应PCR产物形成杂交产物混合液，将混合液加热95 ℃变性5 min，立即冰浴3 min；将杂交反应混合物混匀，经盖片的加样孔加入13.5 μl杂交反应混合物，密封；芯片洗涤液Ⅰ、Ⅱ洗涤芯片，在恒温摇床上使用80～100 r/min转速，室温洗涤3 min，然后以离心半径7 cm，800 r/min 离心5 min，甩干扫描。结果判断：探针信号值与参考值进行比较，如果探针信号值大于或等于该探针的参考值，则判读为阳性，否则判读为阴性，以探针信号的组合情况来确定相应的分枝杆菌种或群。

8. 耐药基因检测[7]：回顾分析NTM感染者同时期相关标本TB-PCR-荧光探针法结果，检测是否存在MTB感染，并应用DNA微阵列芯片法检测耐药基因。步骤如下：每份标本均进行分枝杆菌属探针序列(扩增产物1)、rpoB基因位点突变序列(扩增产物2)、KatG和inhA基因位点突变序列(扩增产物3)扩增，扩增程序按说明书要求进行。扩增产物于95 ℃变性10 min，立即置冰水中3 min，每份标本分为2管，分别加入9 μl杂交缓冲液，其中一管加入3 μl扩增产物1和2，另一管中加入3 μl扩增产物1和3，吹吸混匀后从杂交盒的小孔处向芯片点阵加入13.5 μl杂交混合物，置于50 ℃杂交仪中杂交2 h。按说明书配置洗液1和洗液2，按已设置的洗涤程序洗片，读片结束后置于甩干仪中甩干，然后把芯片放入扫描仪中自动读取数据。结果判读：待测样品某一基因所有检测位点均为野生型则报告该基因为野生型；若待测样本某一个或几个位点为突变型，则报告全部为突变型。

结 果

1.形态分析：对培养管内菌液进行萋-尼抗酸染色，观察到细菌呈分散型生长(逗点样或长杆样)，不同于MTB的典型索状生长，见图1。

A：逗点样；B：长杆样图1 培养管内细菌生长形态(抗酸染色 ×100)

2.菌液成分分析：PNB鉴别培养、免疫胶体金法检测、PCR-荧光探针法进行菌液成分的分析发现1号标本为MTB；2号标本菌液中存在分泌 MPB 64蛋白的抗酸杆菌，且MTB特异性基因序列有拷贝，证明存在MTB；而PNB鉴别培养基上分离出的菌落不分泌MPB 64蛋白，PCR-荧光探针法检测MTB阴性，NTM阳性，经鉴别为NTM，因此，考虑2号标本存在MTB与NTM混合生长。3～58号标本均为NTM。

3.耐药情况分析：对2～58号标本分离出的NTM进行菌种鉴定，结果显示，鸟分枝杆菌7份、胞内分枝杆菌32份、堪萨分枝杆菌4份、偶然分枝杆菌1份、龟-脓肿分枝杆菌10份、耻垢分枝杆菌2份、土分枝杆菌1份。

回顾分析3～58号标本对应的56例NTM感染患者同时期相关标本TB-PCR-荧光探针法结果，发现仅有3～6号这4例患者TB-PCR结果阳性，存在混合感染。对这4例TB-PCR产物进行耐药基因分析，结果均为利福平和异烟肼敏感(野生型)，同时检测2号标本对应患者耐药基因，也为利福平和异烟肼敏感(野生型)。

讨 论

BACTEC MGIT 960液体培养主要用于MTB培养。典型的MTB呈索状生长(即非浑浊的，成颗粒或团块生长)[8]，污染菌呈均匀浑浊生长，这些污染菌抗酸染色为阴性。笔者对培养管内均匀浑浊生长的不典型抗酸杆菌进行了分析，了解菌液的成分，并对分析菌液成分时发现的混合感染进行了深入的探讨。

本研究显示，58份浑浊生长的不典型抗酸杆菌培养管内，细菌生长的形态区别于MTB复合群的索状生长形态，呈分散的逗点和长杆样生长[9-10]。通过对细菌16s特异性序列的鉴别，发现NTM生长的有57份标本。究其原因，可能是NTM含索状因子较少或不含所致。因此，BACTEC MGIT 960培养管浑浊生长可以作为NTM的初步筛查依据，当BACTEC MGIT 960培养管内菌液呈浑浊生长时，应该考虑NTM的存在。

研究中，1号标本经鉴定为MTB，将菌液进行传代培养，抗酸杆菌恢复了索状生长，并分泌 MPB 64 蛋白。其浑浊生长的具体原因可能为细胞壁成分的缺失，L型变异，导致索状因子的减少。2号标本经分析，慢生长分枝杆菌与MTB的生长速度基本相同，两种细菌得到合适的生长条件从而共同生长。1、2号标本提示，BACTEC MGIT 960液体培养中，抗酸染色初步鉴定为抗酸杆菌后，需要进一步鉴定出抗酸杆菌是MTB或NTM。

从2号标本可以看出，MTB与NTM混合感染不能忽略。因为治疗方案的不同，实验室对混合感染的检测可以帮助临床医生及时做出正确诊断[11-12]。本次筛选的57例NTM感染的患者中，回顾分析其同期相关标本的MTB特异性核酸PCR的结果，有5例菌种鉴定为MTB。分析原因，可能为龟-脓肿分枝杆菌等快生长分枝杆菌生长迅速，消耗大量营养物质，导致MTB营养不良，无法繁殖。这5例患者MTB耐药基因均为野生型，对异烟肼和利福平敏感。

综上所述，利用浑浊生长这种细菌形态学上特点，可有助于NTM感染的早期筛查。培养结果结合早期基因检测，可以避免混合感染患者的漏诊。MTB与NTM混合感染时，必须各有一种方法证明两种细菌的存在，如传统的MPB 64蛋白与PNB罗氏培养基检测，或基因层面测定细菌的特异性序列[13]；应建立一个可靠的病原学诊断流程，对混合感染做出明确的诊断，给临床提供可靠的信息。

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(本文编辑：李敬文)

Analysis of acid fast bacilli with turbidity growth in the BACTEC MGIT 960 culture tubes

YANGHan,DANGLi-yun,CUIXiao-li,YOUZhen-yu,TANXiao-wen,LIUYuan.

Xi’anChestHospital,Xi’an710061,ChinaCorrespondingauthor:DANGLi-yun,Email:dangliyun@sina.com

Specimens with mycobacterium positive from Xi’an Chest Hospital between November 2012 and December 2015 were collected, and of them, 58 specimens from 58 patients were with turbidity growth in culture tubes and were found positive using acid-fast staining. The 58 specimens were dealt with acid-fast staining, PNB differential culture, immune colloidal of MPB64 protein, non-tuberculosis mycobacteria (NTM) specific real-time fluorescence quantitative PCR, DNA microarray and drug resistance gene to identify the component of the bacteria. Results ofMycobacteriumtuberculosis(MTB) and NTM specific real-time fluorescence quantitative PCR were reviewed and it was found that all the 58 specimens with turbidity growth growing in types of comma and pod; 56 of them separately grew with NTM, one with MTB separately and one with MTB and NTM mixed. Five cases were infected by both MTB and NTM, and resistance genes of RFP and INH were both wild type. Hence, separate infection of MTB could be confirmed only after ruling out the growth of NTM.

Mycobacteriumtuberculosis; Mycobacterium infections; Diagnosis, differential

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.01.023

710061 西安市胸科医院

党丽云，Email:dangliyun@sina.com

2016-06-02)