色素腺体性状不同棉花近等基因系的遗传分析

渠云芳，段永红，康娜娜，杜海烨，成 莎，黄晋玲

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

色素腺体性状不同棉花近等基因系的遗传分析

渠云芳，段永红，康娜娜，杜海烨，成 莎，黄晋玲

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

采用SRAP标记对色素腺体性状不同棉花近等基因系进行分析。结果表明，39对SRAP引物组合对2对近等基因系材料共扩增出304条带，每对引物组合可以扩增出5.69条多态性带，多态性条带比率达到73%；共扩增出57条特异条带，特异条带比例达到18.9%。遗传相似度分析结果表明，W1与Y1遗传相似系数为0.740 3；Y2与W2的遗传相似系数为0.763 6。聚类分析结果表明，在GS为0.85处，将参试材料分为2个类群，W1与Y1的遗传相似系数比较大，归为一类；W2与Y2的亲缘关系比较近，归为另一类。研究结果可为近等基因系亲缘关系的鉴定以及为腺体基因的进一步研究提供依据。

棉花；色素腺体；近等基因系；SRAP

棉花是一种重要的经济作物，不仅是人类所需要的优质天然纤维的主要来源，而且其种子还是仅次于大豆、棕榈树、油菜、向日葵的蛋白资源和油料资源[1-3]。棉花整个植株上分布有呈不规则形状的黑褐色色素腺体，色素腺体是锦葵科棉属植物及其近缘物种所特有的器官[4]。由于色素腺体内含有对人和反刍类动物有害的物质棉酚，因而被认为是棉属植物应对生物和非生物胁迫的防御器官，腺体的有无、多少与棉花对胁迫的反应密切相关。目前，棉花色素腺体性状已经开始应用于棉花的育种实践[5]，一方面通过培育色素腺体多即棉酚含量高的棉花新品种，以提高棉花对病虫害的抵抗性；另一个方面通过培育棉酚含量低的棉花新品种，以使得棉籽蛋白得以充分利用[6]。

SRAP标记（Sequence-amplified polymorphism，序列相关扩增多态性）是一种新型的分子标记技术，该技术主要是针对开放阅读框进行扩增[7-8]。与其他分子标记相比，SRAP具有简便、稳定、中等产率等特点，能应用于基因定位、克隆、遗传多样性分析以及构建遗传图谱[9]。SRAP现已应用于许多植物的研究，孙红叶等[10]以西府海棠S19杂交组合的F1为材料，采用SRAP标记对BSA群体进行了分析，最终选出了4条与耐盐基因连锁的分子标记。葛海燕等[11]采用SRAP与SSR标记相结合的方法，构建了陆陆杂种遗传连锁图，并且检测到了1个与抗黄萎病相关的QTL。史红丽等[12]采用SRAP标记和SSR标记相结合对47份桃树进行了遗传多样性分析，研究结果与形态学聚类相吻合。林忠旭等[13]用SRAP标记对11份陆地棉材料进行遗传多样性检测，结果表明，在30个引物组合中有15个组合具有多态性，并得到了22个多态性条带，显示了较高的多态性比率。高建明等[14]对47个甜高粱品种进行了SRAP指纹分析，结果建立了可以鉴定不同基因型的SRAP指纹图谱，为以后的研究提供了参考依据。贺润丽等[15]采用SRAP方法对16个款冬居群的遗传多样性进行了分析，其结果从分子水平揭示了不同种质之间的遗传差异。

目前，有关色素腺体形态解剖学方面的研究较多，而对色素腺体的遗传规律、分布模式以及如何运用这些规律调控或诱导腺体的发生还有待于进一步探究[6]。棉花色素腺体性状不同的近等基因系的培育，为腺体基因的深入研究提供了理想材料。SRAP分子标记在棉花育种上已有所应用，但运用SRAP标记对腺体性状的研究还较少。

本研究以色素腺体性状不同近等基因系为研究材料，采用SRAP标记对参试材料进行遗传多样性分析，旨在揭示近等基因系材料的亲缘关系，为腺体基因的进一步定位提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用材料均是从（亚洲棉（Gossypium arboreum）×比克氏棉（G.bickii））×陆地棉（G.hirsutum）3种杂种后代中，经多代回交选育获得的色素腺体性状不同而稳定的近等基因系（表1）。W1与Y1是一对近等基因系，W2与Y2是一对近等基因系。

表1 材料编号及性状

1.2 方法

1.2.1 SRAP标记分析方法

1.2.1.1 DNA的提取、纯化和检测 DNA的提取参照CTAB法[16]，并略有改进。

1.2.1.2 SRAP引物及其来源 SRAP分析所用引物参照LI等[7]发表的引物，由上海生工对所选引物进行合成。引物序列列于表2。

表2 SRAP正向与反向引物序列

1.2.1.3 PCR扩增与电泳 PCR反应在Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler热循环仪上进行。PCR反应体积为20μL：包括Buffer（含镁离子）2μL，dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，引物各0.4 μL，DNA3 μL，0.2 μLTag酶，双蒸水补足20 μL。

PCR反应程序参照LI等[7]介绍的方法。扩增产物经6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，观察统计带型。

1.3 数据处理

统计SRAP电泳条带，把同一位点上有带的记为“1”，无带的记为“0”，缺失的记为“2”；采用NTSYS-pversion 2.11[17]软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 棉花基因组DNA检测

本试验采用改良CTAB法提取基因组DNA，待DNA溶解后，经0.8%琼脂糖进行电泳检测（图1）。从图1可以看出，参试材料的基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳后，主带清晰且很集中，DNA信息完整，没有拖尾现象，适合SRAP分析。

2.2 SRAP引物筛选及多态性分析

100对SRAP引物组合共筛选出39对扩增条带稳定且多态性好的引物，对每对引物在参试材料中的扩增情况进行统计，结果显示，39对引物共扩增出304条带，其中，多态性条带为222条，多态性条带比例介于12.5%～100%，引物组合Me5-Em11，Me8-Em2等的多态性比例达到100%，而引物组合Me3-Em3，Me2-Em2的多态性比例仅为25%。引物不同，扩增的多态性条带数也不相同，扩增条带最少的为4条，最多的为16条，平均每对引物扩增的条带数为7.79条；平均多态性条带为5.69条，占73%（表3）。表明SRAP技术的多态性比较高，适合进行遗传多样性分析。从图2可以看出，材料W1与Y1以及W2与Y2之间存在有明显的差异条带。

表3 39个引物组合扩增多态性

2.3 特异位点分析

39对引物组合对参试材料扩增共产生57条特异条带（表3）。不同引物组合对不同材料进行扩增，所产生的特异位点数量存在差异，特异条带比例为0～57.1%，平均每对引物组合产生的特异条带为1.46条，占18.9%。其中，有的引物组合没有产生特异条带，如Me5-Em3，Me2-Em1等；有的引物产生的特异条带较多，可以达到5条，如Me8-Em2；其余引物扩增产生的特异条带介于1～4条。各个材料产生的特异条带数也存在差异，有腺体材料扩增产生的特异条带为33条，无腺体材料扩增产生的特异条带为22条。利用这些特异条带就可以进一步对近等基因系进行分析，为色素腺体基因的定位提供了依据。

2.4 遗传相似性分析

利用软件NTSYS对参试材料的遗传相似性系数进行了计算，结果显示，W1与Y1之间的遗传相似系数为0.740 3，Y2与W2之间的遗传相似系数为0.763 6（表4），均比理论值0.984 4低，可能是由于W1与Y1，W2与Y2虽然经过多代回交，农艺性状上已达到一致，但在分子水平上，由于供体亲本存在基因连锁累赘现象，导致了近等基因系之间还存在比较大的差异。

表4 参试材料的遗传相似系数（GS）

2.5 聚类分析

参试材料的聚类分析结果如图3所示。从图3可以看出，在GS为0.85处，将参试材料分为两大类，材料W1与Y1由于其亲缘关系比较近，归为一类；材料W2与Y2由于是一对近等基因系，归为另一类。

3 讨论

3.1 色素腺体性状不同棉花近等基因系近等性评价

近等基因系主要是通过回交而得[18]，它们之间除了目标性状外，绝大部分遗传背景相似。课题组前期已对参试材料进行了形态学调查，结果表明，参试材料除了在色素腺体性状上存在差异外，其他农艺性状已基本稳定。本研究采用SRAP对参试材料进行了分子检测，结果发现，2对近等基因系遗传多态性均比较高，W1与Y1的相似系数为0.740 3，Y2与W2的相似系数为0.763 6，但均低于理论值0.984 4，刘雅辉等[9]对23个小麦抗叶锈病近等基因系的SRAP分析结果表明，其参试材料之间的遗传相似系数介于0.72～0.92，与本研究结果一致。理论上，近等基因系之间应存在较低的遗传多态性，而造成近等基因系之间遗传多态性高的原因可能是由于分子检测属于一种抽样检测，不可能对全部位点进行整体检测，故存在一些位点被遗漏[19]。

3.2 SRAP技术在棉花近等基因系研究中的可行性

SRAP是近几年来发展起来的以PCR扩增为基础的又一种新的分子标记[20]，具有简便、稳定、产率高、便于克隆目标片段的优点。伊艳杰等[21]采用240对SRAP引物对小麦感白粉病品种SF42与抗病品种ZB90进行扩增，结果发现，有40%的引物组合能在抗感品种中扩增出稳定的多态性条带。刘雅辉等[22]以Thatcher和23个以Thatcher为遗传背景的小麦抗叶锈病的近等基因系以及Tclr与Thatcher杂交的F2植株为材料，采用SRAP分子标记对小麦抗叶锈病基因Lr19进行研究，结果获得了一个与小麦抗叶锈病基因相连锁的SRAP标记。杨在君等[23]采用SRAP标记分析了小麦三雌蕊近等基因系的遗传背景，结果发现，41对多态性引物共扩增出537条多态性条带，多态性比率达到49.5%。汪保华等[24]采用SRAP对3个黄褐棉近等基因系进行了研究，结果表明，所选出的近等基因系与亲本陆地棉相比，它们的遗传背景基本相同，仅仅是在1，14，19号染色体上存在有黄褐棉的渐渗片段。本研究采用39对引物对参试材料进行扩增，结果表明，共扩增出304条带，产生222条多态性条带，多态性条带率为73%，平均每个引物组合产生5.69条多态性条带，并在参试材料中能扩增出特异条带，表明SRAP技术能够揭示一些遗传基础的实质，能够将存在的差异充分表现出来。

4 结论

本研究采用SRAP对2对色素腺体性状不同的棉花近等基因系进行了分析，结果表明，39对SRAP引物对2对近等基因系材料共扩增出304条带，多态性条带达到222条，多态性条带比率达到73%；共扩增出57条特异条带，特异条带比例达到18.9%。遗传相似度分析表明，W1与Y1遗传相似系数为0.740 3，Y2与W2的遗传相似系数为0.763 6。聚类分析结果表明，在GS为0.85处，将参试材料分为2个类群，W1与Y1的遗传相似数比较大，归为一类；W2与Y2的亲缘关系比较近，归为另一类。

［1］ASH M，DOHLMAN E.Oil crops situation and outlook yearbook[R]. Washinton：United States Department ofAgriculture，2006.

［2］ GETASIMIDIS K，FILLOU D，BABATZIMCPOULOU M，et al. Preparation ofan edible cottonseed protein concentrate and evaluation of its functional properties[J].International journal of food sciences and nutrition，2007，58（6）：486-490.

［3］SUNILKUMAR G，CAMPBELL L M，PUCKHABER L，et al.Engineering cottonseed for use in human nutrition by tissue-specific reduction oftoxic gossypol[J].Proceedings ofthe National Academyof Sciences，2006，103：18054-18059.

［4］邱志坚，刘文哲.棉花色素腺体研究进展[J].鲁东大学学报（自然科学版），2008，24（2）：162-167.

［5］朱乾浩.棉族色素腺体的利用 [J].植物杂志，1992，19（1）：36-37.

［6］谢永芳.棉花腺体形成相关基因的研究 [D].重庆：重庆大学，2008.

［7］ LI G，QUIROS C F.Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a newmarker system based on a simple PCR reaction：its application tomappingand gene taggingin Brassica[J].Theoretical and applied genetics，2001，103（2/3）：455-461.

［8］李武，倪薇，林中旭，等.海岛棉遗传多样性的SRAP标记分析[J].作物学报，2008，34（5）：893-899.

［9］刘雅辉，闫红飞，杨文香，等.23个小麦抗叶锈病近等基因系SRAP多态性[J].中国农业科学，2008，41（5）：1333-1340.

［10］孙红叶，张媛，李中勇，等.苹果砧木耐盐性基因SRAP标记的鉴定及序列分析[J].华北农学报，2015，30（2）：59-63.

［11］葛海燕，汪业春，郭旺珍，等.陆地棉抗黄萎病性状的遗传及分子标记研究[J].棉花学报，2008，20（1）：19-221.

［12］史红丽，韩明玉，赵彩平.桃树遗传多样性的SRAP和SSR标记分析[J].华北农学报，2009，24（8）：187-192.

［13］林忠旭，张献龙，聂以春.新型标记SRAP在棉花F2分离群体及遗传多样性评价中的适用性分析 [J].遗传学报，2004，31（6）：622-626.

［14］高建明，罗峰，裴忠有，等.甜高粱重要种质材料的SRAP指纹分析[J].华北农学报，2010，25（2）：93-98.

［15］贺润丽，平莉莉，王伦宇，等.不同居群款冬种质资源SRAP遗传多样性分析[J].山西农业科学，2014，42（4）：321-323.

［16］CLARKMS.植物分子生物学实验手册[M].北京：高等教育出版社，1998.

［17］ROHLF F J.NTSYS pc：Numerical taxonomy and multivariate analysis systemversion 2.1[M].NewYork，USA：Applied Biostatistics Inc，2000.

［18］夏军红，郑用琏.玉米Rf3近等基因系的分子标记辅助回交选育与效益分析[J].作物学报，2002，28（3）：339-344.

［19］龙卫华，胡茂龙，高建芹，等.油菜MI CMS恢复基因近等基因系的构建与近等性分析 [J].分子植物育种，2011，9（3）：261-269.

［20］苏亮，白建荣，王秀红.玉米cDNA-SRAP反应体系的优化[J].山西农业科学，2010，38（8）：6-9，60.

［21］伊艳杰，胡楠，刘红彦，等.小麦白粉病基因SRAP标记的鉴定及序列分析[J].河南农业科学，2007，36（3）：60-62.

［22］刘雅辉，闫红飞，杨文香，等.小麦抗叶锈病基因Lr19的SRAP标记[J].华北农学报，2007，22（4）：193-196.

［23］杨在君，彭正，松周永红.利用SRAP分子标记评价小麦三雌蕊近等基因系的遗传背景[J].核农学报，2012，26（1）：22-27.

［24］汪保华，王为，庄智敏，等.3个黄褐棉近等基因系的选择及评价[J].中国农学通报，2011，27（24）：45-49.

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《山西农业科学》编辑部

Genetic Analysis of Near-isogenic Lines with Different Pigment Glands on Cotton

QUYunfang，DUANYonghong，KANGNana，DUHaiye，CHENGSha，HUANGJinling
（College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Near-isogenic lines with different pigment glands of cotton were analyzed by SRAP marker in this study.The result showed that a total of304 bands were amplified by39 SRAP primers combinations,5.69 bands with polymorphism were amplified by per primer combination.The ratio ofpolymorphic bands was 73%,57 bands（18.9%）were specific bands.The analysis ofgenetic similarity coefficients showed that the genetic similarity coefficient was 0.740 3 between W1 and Y1,the genetic similarity coefficient was 0.763 6 between W2 and Y2.The cluster analysis showed that the materials were divided into two groups at the similarity coefficient of 0.85,W1 and W2 were clusted firstly,because their genetic similarity was bigger,W2 and Y2 were clusted another group,because their genetic relationship was relative close.The result will provide evidence for the identification of genetic relationship from near-isogenic lines and further studyofpigment gland gene.

cotton;pigment gland;near-isogenic lines;SRAP

S562.03

：A

：1002-2481（2017）01-0001-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.01.01

2016-11-24

山西省科技攻关项目（20130311004-3，20140311004-3）；棉花生物学国家重点实验室开放课题（CB2015A20）

渠云芳（1973-），女，山西祁县人，副教授，硕士，主要从事棉花远缘杂交与杂种优势利用研究工作。黄晋玲为通信作者。