香连片预防小鼠溃疡性结肠炎癌变的作用及机制

董跃滨 尚精娟

(上海市第七人民医院消化科，上海 200137)

香连片预防小鼠溃疡性结肠炎癌变的作用及机制

董跃滨 尚精娟

(上海市第七人民医院消化科，上海 200137)

目的 探讨香连片在小鼠溃疡性结肠炎(UC)癌变预防中的作用机制。方法 将60只小鼠随机分为空白组、模型组、香连片组和柳氮磺胺嘧啶组，每组15只，采用1，2-二甲基肼(DMH)/葡萄聚糖硫酸钠(DSS)复合法诱导小鼠UC癌变模型。采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测DKK-1和WTF-1 mRNA的表达，采用免疫组化法检测β-链蛋白(β-catenin)和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达。结果 与空白组比较，其余各组β-catenin及PANA蛋白表达均升高(P<0.05)；与模型组比较，香连组和对照组β-catenin和PANA蛋白表达均降低(P<0.05)；香连组和对照组β-catenin和PANA蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较，模型组DKK-1 mRNA表达降低，香连组和对照组表达升高，其他各组WTF-1 mRNA均表达升高(P<0.05)；与模型组比较，香连组和对照组DKK-1和WTF-1 mRNA表达均升高(P<0.05)；香连组和对照组DKK-1和WTF-1 mRNA表达无统计学意义(P>0.05)。结论 香连片可以通过抑制β-catenin和PANA蛋白表达、提高DKK-1和WTF-1 mRNA表达阻断Wnt通路，发挥预防UC癌变的作用。

溃疡性结肠炎；癌变；香连片

研究表明，香连片具有抗菌、抗胃肠炎、抗溃疡性结肠炎(UC)等药理作用〔1〕。据报道，约5%的UC患者在疾病进展过程中发生癌变，其癌变机制尚不明确，但研究发现与患者病程、严重程度和复发率密切相关〔2〕。Wnt信号通路在结直肠癌的发病过程中发挥重要作用。β-链蛋白(β-catenin)在Wnt通路中发挥正向调节效应，核内β-catenin水平的升高能够激活下游效应基本的转录过程，是Wnt信号通路的激活标识，参与结直肠癌的进展〔3〕。β-catenin已经作为结肠癌进展的常见标志物。DKK-1是一种外泌型的糖蛋白，在Wnt信号通路中发挥拮抗作用，能够特异性的抑制Wnt信号通路〔4〕。本研究拟构建UC癌变小鼠模型，从分子生物学水平上探讨香连片在UC癌变预防中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料及分组 选择60只7～8 w BALB/C雄性小鼠，体重(21.21±3.11)g，由上海义森生物科技有限公司提供。将60只小鼠随机分成空白组、模型组、香连片组和柳氮磺胺嘧啶对照组，每组15只。

1.2 实验试剂及器材 香连片：0.3 g/片，国药准字Z10900035，购自湖北香连药业有限责任公司；柳氮磺胺嘧啶，0.25 g/片，国药准字H31020450，购自上海中西三维药业有限公司。葡萄聚糖硫酸钠(DSS)(分子量50 kD)购自Fluka公司，1，2-二甲基肼(DMH)购自Sigma公司。小鼠β-catenin、β-catin、DKK-1引物均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，增殖细胞核抗原(PCNA)一抗购自Abcam生物工程有限公司；Trizol购自Superior公司；ABI荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；Elx800NB酶标仪购自美国BioTek公司。

1.3 动物模型 空白组给予生理盐水作为对照，不做其他处理。模型组采用腹腔注射DMH结合饮用DSS法制备UC癌变模型。实验小鼠腹腔注射20 mg/kg DMH，2次/w，在各造模组小鼠饮用生理盐水中添加5%DSS，2 w，以上整个流程(共3 w)为1个循环，重复以上过程3个循环。从第10周开始不做处理，持续至第18周。香连组：将香连片溶解在蒸馏水中，用药浓度13.5 mg/ml，自造模前1 w开始用药，至造模第10周。对照组：将柳氮磺胺嘧啶溶解在蒸馏水中，用药浓度7.5 mg/ml，自造模前1 w开始用药，至造模第10周。

1.4 检测DKK-1和WTF-1 mRNA的表达 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对肠组织中DKK-1和WTF-1 mRNA的表达进行半定量测量。取新鲜的病变肠组织和正常肠组织分别提取RNA，操作过程严格按照RNA提取试剂盒的操作说明进行。采用Biotek酶标仪检测RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，PCR仪反应程序：95℃下变性30 s，60℃下退火30 s，循环40次。DKK-1引物序列：上游序列5′-GACTCTTGACAACTACCAGC-3′，下游序列5′-AAATGGCTGTGGTCAGAGGG-3′；WTF-1引物序列：上游序列5′-TGTATGAACGGTGGTCTGTG-3′，下游序列5′-ATTTACCTCCATTTCGGGAG-3′。

1.5 检测β-catenin和PCNA蛋白表达 采用免疫组化法检测β-catenin和PCNA蛋白表达。各组织切片脱蜡至水，100℃加热，抗原修复；室温下，过氧化氢-甲醇(3%)封闭20 min；牛血清白蛋白溶液(5%)封闭30 min。滴加1∶500的β-catenin一抗和1∶250的PANA一抗，4℃摇床过夜，加二抗，常温孵育30 min。二氨基联苯胺(DAB)染色液显色，控制显色时间在10 min；根据阳性染色位置调整复染、脱水、透明、封片。

1.6 蛋白表达结果判定 当细胞膜、细胞质或细胞核内出现黄色棕黄色颗粒定义为β-catenin阳性，当细胞核内出现棕黄色颗粒为PCNA阳性。判断标准：高倍镜下选择5个视野，依据阳性细胞的比例及其着色强度计分。(1)阳性细胞数分值为0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(25%～50%)、3分(>50%)；(2)阳性细胞着色强度分值为0分(阴性)、1～2分(弱阳性)、3～5分(中等阳性)、6～7分(强阳性)。

1.7 基因相对表达量判断 采用ΔΔCT法分析基因的相对表达量，其相对表达量为2-ΔΔCT。ΔΔCT=(观察样本ΔCT-对照样本ΔCT)，T=(观察样本目的基因CT-内参基因CT)-(对照样本目的基因CT-内参基因CT)。

1.8 统计学方法 应用SPSS16.0进行方差分析和LSD法。

2 结 果

2.1 各组β-catenin和PCNA蛋白表达比较 各组间β-catenin和PCNA蛋白表达均有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，其余各组β-catenin及PCNA蛋白表达均升高(P<0.05)；与模型组比较，香连组和对照组均降低(P<0.05)；香连组和对照组β-catenin和PCNA蛋白表达无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 各组DKK-1和WTF-1 mRNA表达比较 各组间DKK-1 mRNA和WTF-1 mRNA表达量均有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较，模型组DKK-1 mRNA表达降低，香连组和对照组表达升高，其他各组WTF-1 mRNA均表达升高(P<0.05)；与模型组比较，香连组和对照组DKK-1和WTF-1 mRNA表达均升高(P<0.05)；香连组和对照组无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组β-catenin、pCNA及DKK-1、WTF-1 mRNA比较

与空白组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3 讨 论

UC病变常累及直肠和结肠，黏膜出现弥漫性炎细胞浸润，伴有多发性溃疡。UC癌变的发展经历着炎症-增生-癌变的进程〔5〕。目前，UC治疗药物主要有免疫抑制剂、类固醇激素和氨基水杨酸类。氨基水杨酸类常用于中轻型患者，免疫抑制类和激素类常用于重度患者的治疗。前期有研究发现，香连片能够预防UC的癌变进程。Wnt信号通路是一条信号转到途径，在许多发育过程和机体组织的动态平衡张发挥重要作用，还参与了干细胞的分化过程〔6〕。其中，Wnt/β-catenin信号通路也被称为经典Wnt通路，通过调控细胞内的β-catenin，对下游靶基因的表达进行调控〔7〕。首先，由Axin、APC和GSK3β形成磷酸化胞质，被磷酸化和泛素化后，被蛋白酶体降解。当细胞外配体Wnt与细胞膜上的Frizzled受体及LRP5/6受体结合后，激活Wnt信号通路。激活的受体将信号传递给细胞质中的蛋白，使得β-catenin降解并积累。大量β-catenin进入细胞核，与LEF/TCF等转录因子结合后，激活下游靶基因的调控。在Wnt信号通路的过程中，DKK一方面可以与LRP5/6结合，干扰LRR5/6和Frizzled复合物的结合；另一方面，能够与Krm受体和LRP6形成复合物，发生内吞现象，细胞膜表面LRP6受体被清楚，抑制Wnt信号〔8〕。WIF-1是一种内源性拮抗剂，在肿瘤发生的过程进程中发挥重要生物学作用。WIF-1能够与Wnt配体蛋白结合抑制其信号通路〔9〕。

本研究结果说明香连片能够下调β-catenin蛋白的表达，进而抑制Wnt通路的激活。且香连片能够上调DDK-1和WTF-1 mRNA的表达，抑制Wnt通路，与殷银霞等〔10〕、王欣等〔11〕研究一致。综上所述，香连片可以通过抑制β-catenin和PANA蛋白表达、提高DKK-1和WTF-1 mRNA表达阻断Wnt通路，发挥预防UC癌变的作用。

1 Yoshioka K，Ueno Y，Tanaka S，etal.Role of natural killer T cells in the mouse colitis-associated colon cancer model〔J〕.Scand J Immunol，2012；75(1)：16-26.

2 段丽文，徐北辰.溃疡性结肠炎的诊治进展〔J〕.辽宁医学院学报，2012；33(6)：571-4.

3 Li M，Cai H，Yang Y，etal.Perichondrium mesenchymal stem cells inhibit the growth of breast cancer cells via the DKK-1/Wnt/β-catenin signaling pathway〔J〕.Oncol Rep，2016；36(2)：936-44.

4 Kim HY，Park JH，Won HY，etal.CBX7 inhibits breast tumorigenicity through DKK-1-mediated suppression of the Wnt/β-catenin pathway〔J〕.FASEB J，2015；29(1)：300-13.

5 罗凤燕，白爱平.溃疡性结肠炎动物模型的研究进展〔J〕.世界华人消化杂志，2013；21(7)：607-13.

6 Yong X，Tang B，Xiao YF，etal.Helicobacter pylori upregulates nanog and oct4 via wnt/β-catenin signaling pathway to promote cancer stem cell-like properties in human gastric cancer〔J〕.Cancer Lett，2016；374(2)：292-303.

7 Hu N，Wang C，Zheng Y，etal.The role of the Wnt/β-catenin-Annexin A1 pathway in the process of sevoflurane-induced cognitive dysfunction〔J〕.J Neurochem，2016；137(2)：240-52.

8 Tiwari SK，Agarwal S，Seth B，etal.Inhibitory effects of bisphenol-a on neural stem cells proliferation and differentiation in the rat brain are dependent on wnt/β-catenin pathway〔J〕.Mol Neurobiol，2015；52(3)：1735-57.

9 段 飞，李书忠，朱万平，等.转入WIF-1或5-氮杂-2′-脱氧胞苷去甲基化抑制骨肉瘤模型鼠的肿瘤生长〔J〕.中国组织工程研究，2016；20(27)：3984-91.

10 殷银霞，许雅清，李海龙，等.IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ在脾肾阳虚型溃疡性结肠炎模型大鼠血清及组织中的表达〔J〕.中国实验动物学报，2015；23(2)：139-42.

11 王 欣，王伟明，宋亚娟，等.香连胶囊对大鼠急性肠炎的作用〔J〕.中国实验方剂学杂志，2013；19(3):212-5.

〔2016-10-25修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

董跃滨(1962-)，女，硕士，主任医师，主要从事溃疡性结肠炎发病机制的研究。

R574.63

A

1005-9202(2017)02-0297-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.016