支架蛋白RACK1小干扰RNA抑制卵巢癌细胞CAOV3的增殖、迁移和侵袭

孙 静 任丽莉 张晓玉 刘 超

(锦州医科大学基础医学院发育生物学教研室，辽宁 锦州 121001)

支架蛋白RACK1小干扰RNA抑制卵巢癌细胞CAOV3的增殖、迁移和侵袭

孙 静 任丽莉1张晓玉 刘 超

(锦州医科大学基础医学院发育生物学教研室，辽宁 锦州 121001)

目的 观察支架蛋白RACK1小干扰RNA(siRNA)对卵巢癌CAOV3细胞增殖、迁移和侵袭的影响和基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的表达变化。方法 体外培养CAOV3细胞，实验分scramble siRNA组和RACK1 siRNA组；Lipofectamine 2000转染CAOV3细胞，Western印迹检测RACK1的干涉效能；MTT法测定CAOV3细胞的增殖率；划痕实验和transwell迁移和侵袭实验研究RACK1对细胞体外增殖、迁移和侵袭运动能力的影响；Western印迹检测CAOV3细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达。结果 与scramble siRNA组比较，RACK1 siRNA组RACK1的蛋白表达水平降低，明显抑制CAOV3细胞的增殖、迁移和侵袭，降低MMP-2和MMP-9蛋白表达。结论 下调RACK1表达可抑制卵巢癌细胞CAOV3的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与改变MMP-2和MMP-9蛋白表达相关。

RACK1；siRNA；卵巢癌；CAOV3

RACK1定位于人的第5号染色体，编码35 kD的蛋白质，其结构包含七个WD40重复序列。它与G蛋白亚单位具有同源性，作为蛋白激酶C的胞内受体而被首次发现〔1〕。很多报道提示RACK1的WD40重复序列正是RACK1与众多蛋白相互作用的物质基础，正是因为这些与RACK1相互作用蛋白在细胞各项生理功能的重要作用，才使人们关注RACK1，它可能参与调控许多重要的细胞功能，包括细胞生长、黏附、运动及分化〔2～5〕。有报道RACK1促进人黑色素瘤、口腔鳞癌、乳腺癌等肿瘤转移〔6～8〕，但RACK1与卵巢癌生物学行为的相关性如何目前尚不清楚。本研究拟通过对RACK1与卵巢癌细胞生物学行为相关性及其机制研究，阐明卵巢癌增殖、迁移运动和侵袭转移的分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 DMEM/F12培养液，Transwell小室(Corning公司)；RACK1 siRNA和scrambled siRNA(上海吉玛公司合成)；Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)；RACK1(鼠单克隆抗体，BD公司)、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9(兔多克隆抗体，Cell Signaling Technology公司)；HRP标记的山羊抗兔，抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京碧云天生物技术公司)。BB16UV CO2培养箱(Heraeus)；凝胶自动成像仪GDS8000、水浴式电转印槽、电泳仪(Bio-Rad，美国)。

1.2 细胞培养 人卵巢癌细胞CAOV3购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所，生长于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中(含100 U/ml青霉素和50 U/ml链霉素)，37℃、5%CO2饱和湿度的温箱中培养，每2天换液一次，0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.3 RACK1小干扰RNA(siRNA)的合成和转染 针对人RACK1(GenBank No.NM_006098)的RNAi靶点序列：正义链5'-CAGATTGTCTCTGGATCTCGA-3'，反义链5'-UCGAGAUCCAGAGACAAUCUG-3'〔6〕，由上海吉玛公司纯化合成。CAOV3细胞接种于6孔细胞培养板中，细胞转染按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行。20 μmol/L scramble siRNA或RACK1 siRNA 转染细胞48 h后收集细胞进行后续实验。

1.4 MTT法检测CAOV3细胞生长抑制率 取对数生长期CAOV3细胞，调整细胞数接种于96孔板培养板上，每组6个平行复孔；37℃培养箱中培养24 h后，在细胞融合率达80%～90%后，进行转染；24 h或48 h后，取出96孔板，在每孔中加入新鲜配制的20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，再次将96孔板放入培养箱中继续培养4 h；弃去培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡15 min，充分溶解紫色结晶。通过酶标仪测定490 nm测吸光度值(A值)，测定细胞生长抑制率。

1.5 划痕试验 将生长至融合度达90%的CAOV3细胞接种于24孔板，用黄色枪头划痕，PBS清洗细胞3次去除划下的细胞，细胞转染后继续培养24～48 h，利用倒置显微镜标尺，不同时间点(0、6、12、24和48 h)监测划痕宽度变化，测量划痕宽度，摄像记录。

1.6 侵袭实验 在Transwell小室(24孔板)滤膜的上表面铺100 μl Matrigel(100 mg/ml)，于37℃孵育4～5 h使之固化；温热的无血清培液轻轻冲洗凝固的Matrigel；细胞以5×104/孔的密度接种于带8 μm微孔膜的Transwell小室的上室，用含0.5%胎牛血清的培养液培养，下室加入500 μl含20%胎牛血清的培养液于37℃培养箱孵育，每组设8个复孔。培养48 h后，弃培养液，用无水乙醇室温固定细胞5 min，PBS室温清洗细胞3次，苏木素伊红染色后，用棉签拭去小室上室面无侵袭性细胞。倒置显微镜下随机选择5个视野，计数穿过8 μm微孔膜的侵袭细胞数目。

1.7 迁移实验 不铺Matrigel胶，其余步骤同1.6。

1.8 Western印迹方法检测RACK1、MMP-2和MMP-9的蛋白表达 RIPA蛋白裂解液提取收集转染48 h后的细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，5×SDS样品缓冲液煮沸5 min，离心后上样，10%SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，含5%脱脂奶粉的TBST(pH7.4)封闭滤膜，再分别与RACK1、MMP-2和MMP-9抗体(稀释比为1∶1 000) 及β-actin抗体(稀释比为1∶1 000) 4℃温育过夜。TTBS洗膜3次，HRP耦联的IgG作为二抗(稀释比为1∶5 000)室温温育2 h，重复洗膜3次，ECL发光法显色。

1.9 统计学方法 应用Graphpad prism5软件进行方差分析。

2 结 果

2.1 CAOV3细胞转染RACK1 siRNA显著下调RACK1的表达 与mock组和scramble siRNA组比较，CAOV3细胞转染RACK1 siRNA明显抑制内源性RACK1的蛋白表达，见图1。

1～3：mock组、scramble siRNA组、RACK1 siRNA组图1 CAOV3细胞转染RACK1 siRNA后RACK1蛋白表达水平

2.2 下调RACK1的表达抑制CAOV3细胞的体外增殖 CAOV3细胞生长24 h后，与mock组(92.80±3.09)%和scramble siRNA组(89.80±3.96)%相比，转染RACK1 siRNA(74.80±2.76)%能够显著抑制CAOV3细胞的生长增殖(P<0.01)；细胞生长48 h后，与mock组(88.28±4.91)%和scramble siRNA组(84.75±3.35)%相比，RACK1 siRNA转染组(54.80±2.91)%细胞生长明显受到抑制(P<0.01)。

2.3 下调RACK1表达抑制CAOV3细胞迁移 CAOV3细胞转染48 h后，RACK1 siRNA转染组细胞迁移的数量较scramble siRNA组少，相对距离较远。两组细胞48 h愈合率分别为(34.80±1.96)%和(92.43±4.8)%，差异显著(P<0.01)，见图2。Transwell迁移实验结果表明，RACK1 siRNA转染组穿过微孔膜的细胞数(45.53±5.36)较scramble siRNA转染组细胞(242.67±18.82)少，差异有显著性(P<0.01)，见图3。

2.4 下调RACK1表达抑制CAOV3细胞侵袭 Transwell侵袭实验也显示与对照组(193.28±21.53)相比，转染RACK1 siRNA组CAOV3细胞穿过麦氏胶的细胞(57.64±6.89)明显减少，见图4。

2.5 下调RACK1的表达抑制CAOV3细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达 与mock组和scramble siRNA组相比，RACK1 siRNA转染组CAOV3细胞后MMP-2和MMP-9蛋白的表达明显降低，见图5。

图2 划痕实验检测转染RACK1 siRNA后CAOV3细胞的迁移情况(×200)

图3 Transwell实验检测转染RACK1 siRNA CAOV3细胞的迁移情况(×200)

图4 Transwell实验检测转染RACK1 siRNA CAOV3细胞的侵袭情况(×200)

1～3：mock组、scramble siRNA组、RACK1 siRNA组图5 CAOV3细胞转染RACK1 siRNA后MMP-2和MMP-9蛋白表达

3 讨 论

恶性肿瘤生长的高级阶段，不仅涉及肿瘤细胞的生长，更重要的是肿瘤细胞的转移，这也是阻碍卵巢癌治疗的首要因素。肿瘤转移是在多基因改变的基础上，涉及诸多活性分子和多种调控机制的序贯连续的多环节过程。因此，阻断其中一个环节或改变任意调控因子的分布、表达和功能状态，都可能成为控制肿瘤转移的有效手段〔5〕。表明干涉RACK1表达后，CAOV3细胞出现明显的生长抑制状态，划痕实验结果表明RACK1 siRNA组的细胞愈合划痕的比例明显低于对照组。Transwell迁移试验验证了RACK1 siRNA组细胞穿过微孔膜发生迁移的细胞数量明显少于对照组，同划痕愈合实验结果相一致。Transwell侵袭试验也表明特异性抑制RACK1表达，能够显著阻碍CAOV3细胞的侵袭。肿瘤转移的重要步骤是肿瘤细胞外基质迁移和入侵，各种癌症中已观察到其细胞外基质成分的改变〔9〕。肿瘤的侵袭和迁移很大程度上依赖肿瘤细胞的重塑和对细胞外基质的改变，如对细胞外基质降解。MMP-2和MMP-9可降解细胞外基质，破坏上皮组织的基底膜，肿瘤细胞穿过破损的基底膜发生转移，参与肿瘤的侵袭〔10〕。本研究提示RACK1可能通过调节MMP-2和MMP-9蛋白的表达，促进卵巢癌CAOV3细胞的迁移和侵袭，这与Cao等〔8〕和Wang等〔5〕的观察结果相一致。综上，下调支架蛋白RACK1的表达显著抑制卵巢癌细胞CAOV3的细胞增殖、迁移和侵袭，其机制可能与降低CAOV3细胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表达相关，为深入研究RACK1作为卵巢癌的分子生物学标记物和靶点提供理论基础和实验依据。

2 Ruan Y，Sun L，Hao Y，etal.Ribosomal RACK1 promotes chemoresistance and growth in human hepatocellular carcinoma〔J〕.J Clin Invest，2012;122(7)：2554-66.

3 Deng YZ，Yao F，Li JJ，etal.RACK1 suppresses gastric tumorigenesis by stabilizing the β-catenin destruction complex〔J〕.Gastroenterology，2012;142(4)：812-23.

4 Cheng D，Zhu X，Barchiesi F，etal.Receptor for activated protein kinase C1 regulates cell proliferation by modulating calcium signaling〔J〕.Hypertension，2011;58(4)：689-95.

5 Wang F，Osawa T，Tsuchida R，etal.Downregulation of receptor for activated C-kinase 1 (RACK1) suppresses tumor growth by inhibiting tumor cell proliferation and tumor-associated angiogenesis〔J〕.Cancer Sci，2011;102(11)：2007-13.

6 Shi S，Deng YZ，Zhao JS，etal.RACK1 promotes non-small-cell lung cancer tumorigenicity through activating sonic hedgehog signaling pathway〔J〕.J Biol Chem，2012;287(11)：7845-58.

7 Robles MS，Boyault C，Knutti D，etal.Identification of RACK1 and protein kinase Calpha as integral components of the mammalian circadian clock〔J〕.Science，2010;327(5964)：463-6.

8 Cao XX，Xu JD，Xu JW，etal.RACK1 promotes breast carcinoma proliferation and invasion/metastasis in vitro and in vivo〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2010;123(2)：375-86.

9 Hadler-Olsen E，Winberg JO，Uhlin-Hansen L.Matrix metalloproteinases in cancer：their value as diagnostic and prognostic markers and therapeutic targets〔J〕.Tumour Biol，2013;34(4)：2041-51.

10 DI Carlo A.Matrix metalloproteinase-2 and-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and-2 in sera and urine of patients with renal carcinoma〔J〕.Oncol Lett，2014;7(3)：621-6.

〔2015-09-01修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

Small interfering RNA of RACK1 inhibiting cell proliferation,migration and invasion in ovarian cancer CAOV3 cells

SUN Jing,REN Li-Li,ZHANG Xiao-Yu,etal.

Department of Development Biology of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121001,Liaoning,China

Objective To observe the effects of double-stranded small interfering RNA (siRNA) of scaffolding protein RACK1 on the cell proliferation,migration,invasion of ovarian cancer CAOV3 cells and the protein expression levels of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 in CAOV3 cells.Methods CAOV3 cells were cultured in vitro and transfected with RACK1 siRNA and scramble siRNA randomly.The transfected efficiency of RACK1 siRNA was determined by Western blot,the proliferation rate of CAOV3 cells was assayed by MTT,the cell migration and invasion of CAOV3 cells were examined by wound healing,transwell migration and invasion experiment.The MMP-2 and MMP-9 protein expression levels were detected by Western blot.Results Compared with scramble siRNA group,RACK1 siRNA inhibited the proliferation,migration and invasion of CAOV3 cells and decreased the protein expression of MMP-2 and MMP-9.Conclusions RACK1 silencing decreases the proliferation,migration and invasion of ovarian cancer CAOV3 cells via down-regulation of the protein expression of MMP-2 and MMP-9 in CAOV3 cells.

RACK1；siRNA；Ovarian cancer；CAOV3

国家自然科学基金资助项目(31371173)；辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201310160021)

刘 超(1978-)，女，副教授，博士，主要从事肿瘤分子生物学研究。

孙 静(1992-)，女，主要从事肿瘤分子生物学研究。

R581.3

A

1005-9202(2017)02-0263-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.002

1 神经生物学教研室