小儿腹痛草中獐牙菜苦苷与龙胆苦苷的含量测定

王 丽 陈 芬 符德欢* 高 丽 戚育芳 张晓南

1.云南省药物研究所、云南白药集团创新研发中心、云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室,云南 昆明 650111； 2.云南中医学院,云南 昆明 650500

小儿腹痛草中獐牙菜苦苷与龙胆苦苷的含量测定

王 丽1陈 芬2符德欢1*高 丽1戚育芳1张晓南1

1.云南省药物研究所、云南白药集团创新研发中心、云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室,云南 昆明 650111； 2.云南中医学院,云南 昆明 650500

目的：建立小儿腹痛草中獐牙菜苦苷与龙胆苦苷的含量测定方法。方法：色谱柱：Phenomenex luna C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水溶液(22：78)；流速：1.0mL/min；检测波长239nm；柱温：30℃。结果：獐牙菜苦苷的线性范围0.0488～4.875μg(r=0.9998)，平均回收率为99.57%，RSD=3.30%；龙胆苦苷的线性范围0.0215～2.150 μg(r=0.9995)，平均回收率为97.80%，RSD=2.04%。结论：该方法准确可靠，重复性好，可以作为小儿腹痛草中獐牙菜苦苷与龙胆苦苷的含量测定方法。

小儿腹痛草；獐牙菜苦苷；龙胆苦苷；HPLC；含量测定

小儿腹痛草为龙胆科獐牙菜属斜茎獐牙菜SwertiapatensBurk.的全草。《新华本草纲要》以伸展獐牙菜之名载其：“全草，味苦，有解痉、止痛、安眠功能。用于小儿功能性腹痛”[1]，云南彝族用其全草治疗消化不良、腹痛、牙痛等，且历史已久[2]。小儿腹痛草生于海拔1100～2500m的石灰岩松林下、石灰岩腐殖质土壤中及石灰岩山坡草地，分布于云南中部、东北部及四川南部[3]。小儿腹痛草含獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、齐墩果酸等成分，獐牙菜苦苷主要具有解痉、镇痛作用；龙胆苦苷具有利胆、抗炎、健胃、降压等作用，具有较好的开发前景。为了进一步评价该药材，将以其所含獐牙菜苦苷及龙胆苦苷为目标成分进行定量分析研究。据查阅文献，目前还未见用高效液相色谱法测定小儿腹痛草中獐牙菜苦苷及龙胆苦苷含量的文献报道，本文建立了相应的测定方法，为进一步深入开发该药材提供了一定的理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-2010AHT日本岛津高效液相色谱仪，LCsolution工作站；FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 材料 獐牙菜苦苷(批号：0785-200203，纯度98.6%)、龙胆苦苷对照品(批号：110770-200510，纯度99%)等购自中国药品生物制品检定所。甲醇(色谱纯，MERCK，批号：122250)；水为超纯水。小儿腹痛草经云南省药物研究所高丽、戚育芳正高级工程师鉴定为斜茎獐牙菜SwertiaPatensBurk.，药用部位为全草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex luna C18(4.6mm×250mm，5m)；流动相：甲醇-水溶液(22：78)；流速：1.0mL/min；检测波长239nm；柱温：30℃；进样量：10μL；理论塔板数按獐牙菜苦苷峰计算应不低于3000、按龙胆苦苷峰计算应不低于5000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取獐牙菜苦苷7.8 mg、龙胆苦苷2.15mg分别置于10mL容量瓶中，加甲醇制成0.78mg/L，0.215mg/L的溶液，摇匀，0.45m的微孔滤膜过滤后作为对照品储备液。

2.3 样品溶液的制备 取小儿腹痛草药材细粉0.2g，精密称定，加甲醇10mL/每次，超声2次，每次30min，过滤，合并滤液后定容至25mL，摇匀，即得供试品溶液，0.45 m微孔滤膜滤过，取续滤液用于测定样品中龙胆苦苷的含量。

精密移取供试品溶液1mL于10mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45m的微孔滤膜滤过，取续滤液用于测定样品中獐牙菜苦苷的含量。

2.4 线性关系考察 依次精密吸取獐牙菜苦苷、龙胆苦苷对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL，分别置于10mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列质量浓度的对照品溶液。在上述色谱条件下，分别进样10μL，记录色谱图以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。回归方程獐牙菜苦苷Y=774600X-21622(r=0.9998)，龙胆苦苷Y=1E+0.6X-7700.9(r=0.9995)，獐牙菜苦苷与龙胆苦苷分别在0.04875～4.875 μg(r=0.9998)、0.0215～2.15 μg(r=0.9995)线性关系良好。

2.5 精密度试验 分别取浓度为0.195 mg/mL的獐牙菜苦苷，0.086 mg/mL的龙胆苦苷对照品溶液，按选定色谱条件重复测定6次，结果獐牙菜苦苷、龙胆苦苷峰面积的RSD分别为0.09%、0.69%。

2.6 重复性试验 准确称取同一批小儿腹痛草样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算獐牙菜苦苷和龙胆苦苷质量分数的RSD分别为1.63%、2.08%。

2.7 稳定性试验 取同一批样品，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温放置，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h测定峰面积，计算獐牙菜苦苷和龙胆苦苷峰面积的RSD分别为0.78%、3.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

2.8.1 獐牙菜苦苷的加样回收率试验 称取已测定含量的小儿腹痛草药材0.2g，3份，每次加甲醇10mL，超声2次，每次30min，过滤，合并滤液后定容至25mL，摇匀，即得3个平行供试品溶液。分别移取每份供试品溶液1mL于25mL容量瓶中，每个供试品溶液3份，共9份，加入獐牙菜苦苷低、中、高3份对照品溶液，进样分析，计算平均回收率为99.57%，RSD为3.30%。见表1。

表1 獐牙菜苦苷加样回收率试验结果

2.8.2 龙胆苦苷的加样回收率试验 称取已测定含量的小儿腹痛草药材0.2g，共9份，加入龙胆苦苷低、中、高3份对照品溶液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算平均回收率为97.80%，RSD为2.04%。见表2。

表2 龙胆苦苷加样回收率试验结果

2.9 样品测定 精密称取两个产地小儿腹痛草药材粉末0.2g，每个产地三份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依照上述色谱条件进行测定，结果见图1～4，表3。

表3 样品测定结果 (n=2)

3 讨论

3.1 提取方法选择 分别选择了冷浸法(甲醇冷浸过夜)，超声法(甲醇超声30min)，热浸法(甲醇回流30min)三种提取方法提取样品，结果超声提取时两种苦苷的含量高于冷浸法和热浸法，故选择超声提取。

3.2 提取溶剂选择 分别选择以甲醇、95%乙醇、75%乙醇为溶剂超声提取样品，结果甲醇提取时提取率较乙醇提取时高，故选择甲醇为提取溶剂，这与獐牙菜属常用提取溶剂相吻合。

3.3 提取时间考察 分别考察了甲醇超声提取15、30、45min时对样品中两种苦苷含量的影响，结果与提取15min相比，提取30min时两种苦苷的含量明显增加，但与提取45min时相差不大，故选择30min的提取时间。

3.4 提取次数考察 在甲醇超声提取30min的前提下，考察其提取次数对两种苦苷含量的影响，结果2次与3次相差不大，结果确定为2次。

通过对小儿腹痛草中獐牙菜苦苷和龙胆苦苷含量的测定，发现小儿腹痛草中獐牙菜苦苷的含量较高，高达24.175%。根据已报道文献，该属植物中獐牙菜苦苷含量在0.091%～13.137%之间不等。

獐牙菜苦苷能明显抑制中枢神经系统，具有显著的镇痛和镇静作用，而獐牙菜的镇痛和解痉作用是獐牙菜苦苷治疗胃肠道疼痛的药理基础[4]。测定獐牙菜苦苷的含量，在一定程度上揭示小儿腹痛草是一味很好的止痛药。目前，以小儿腹痛草为主成分的中药制剂甚少，本文的研究可为以后更好的开发利用该药材提供部分理论依据。

[1]吴征镒.新华本草纲要(第二册)[M].上海：上海科学技术出版社，1991.

[2] 梁钜忠，雷伟亚.云南民族药斜茎獐牙菜的实验研究[J].云南医药，1984，5(2)：107-108 .

[3] 罗开均.彝族药“落孺疴”原植物的研究[J].中药通报，1984，9(5)：11-12.

[4] 郭爱华.龙胆科獐牙菜属药用植物化学成分和药理作用的研究进展[J].山西中医学院学报，2005，6(1)：57-59 .

(编辑：陶希睿)

Determination of the Content of National Medicine inSwertiapatensof Swertiamarin and Gentiopicroside

WANG Li1CHEN Fen2FU Dehuan1*GAO Li1QI Yufang1ZHANG Xiaonan1

1.Yunnan Institute of Materia Medica/ Yunnan Bai Yao Group Innovation and R&D Center Yunnan Province Company/Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation,Kunming 650111,China;2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Kunming 650500,China

Objective To estebulish a HPLC method for the determination ofSwertiapatens.Methods The analysis was carried out on all analytical column C18(4.6mm×250mm, 5μm) .Mobile phase was methyl alcohol-water(22：78).The flow rate was 1.0 ml·min-1and the detective wavelength was set at 239nm with column temperature of 30℃．Rusults The linear range was 0.0488～4.875μg(r=0.9998)and the average recovery was 99.57% with theRSDof 3.30% for swertiamrin.The linear range was 0.0215～2.150μg(r=0.9995)and the average recovery was 97.80%with theRSDof 2.04% for Gentiopicroside.Conclution This method was accurate and reliable.It can be used for determination of swertiamrin and Gentiopicroside in the Swertia patens.

SwertiaPatens；Swertiamrin；Gentiopicroside；HPLC；Determination of Content

2016-10-31

王丽(1983-)，女，工程师，主要从事中药材质量评价研究，E-mail：liwangshengyao@163.com

符德欢(1976-)，男，高级工程师，主要从事天然药物、民族药资源调研与药材鉴定。 E-mail：fudehuan@126.com

R283

A

1007-8517(2017)02-0035-03