芍药内酯苷和芍药苷对慢性束缚应激大鼠神经营养因子以及一氧化氮影响的研究

朱映黎++王林元　王成龙　赵丹萍　王莎　费文婷　张建军

[摘要] 研究芍药内酯苷、芍药苷对慢性束缚应激肝郁大鼠的作用及机制。以氟西汀及逍遥丸为对照，检测体重，糖水消耗量，并进行旷场行为学实验；格瑞斯比色法检测海马一氧化氮（NO）的含量；酶免法（ELISA）检测海马脑源性神经营养因子（BDNF）的含量；RTqPCR法检测海马神经元一氧化氮合酶（nNOS）mRNA表达；Western blot法检测海马中nNOS以及BDNF的蛋白表达。与模型组相比，30 mg·kg-1芍药苷、30 mg·kg-1芍药内酯苷明显升高穿行次数（P<0.05；P<0.01）；芍药苷、芍药内酯苷明显降低NO水平（P<0.05，P<0.01；P<0.05，P<0.05）；30 mg·kg-1芍药苷与30 mg·kg-1芍药内酯苷明显升高BDNF水平（P<0.05）。与模型组相比，芍药苷、芍药内酯苷明显降低nNOS mRNA表达（P<0.01；P<0.05）；30 mg·kg-1芍药苷、30 mg·kg-1芍药内酯苷明显升高BDNF 蛋白表达（P<0.05）。芍药内酯苷、芍药苷为白芍柔肝解郁功效的有效成分，其作用机制与调节海马NO含量以及BDNF的表达有关。

[关键词] 芍药内酯苷； 芍药苷； 肝郁证； 一氧化氮； 脑源性神经营养因子

Investigation of effects of albiflorin and paeoniflorin on hippocampal BDNF and NO in chronic restraint stress rats

ZHU Yingli， WANG Linyuan， WANG Chenglong， ZHAO Danping， WANG Sha， FEI Wenting， ZHANG Jianjun*

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

[Abstract] This paper aimed to investigate the antidepressantlike effects and the mechanism of the albiflorin， paeoniflorin on rats with chronic restraint stress model. Fluoxetine and Xiaoyao group served as the positive control， body weight， sucrose preference test and the open field behavioral experiment were measured， the levels of nitric oxide （NO） in hippocampus were detected by Greg colorimetric method. Furthermore， the levels of brain derived neurotrophic factor （BDNF） in hippocampus were detected by ELISA. Finally， the expressions of nNOS mRNA in hippocampus detected by RTqPCR， the protein levels of nNOS and BDNF in hippocampus were detected by Western blot. Compared with the model group，the pass counts of paeoniflorin group（30 mg·kg-1） and albiflorin group（30 mg·kg-1） were obviously increased（P<0.05，P<0.01）. Furthermore， compared with the model group，the levels of NO in paeoniflorin groups（30 mg·kg-1 and 15 mg·kg-1） and albiflorin groups（30 mg·kg-1 and 15 mg·kg-1） were all significantly decreased（P<0.05，P<0.01； P<0.05， P<0.05）. BDNF levels of paeoniflorin group（30 mg·kg-1） and albiflorin group（30 mg·kg-1） were obviously increased（P<0.05）. Finally， compared with the model group， the expressions of nNOS mRNA of paeoniflorin groups（30 mg·kg-1 and 15 mg·kg-1） （P<0.01， P<0.01） and albiflorin groups（30 mg·kg-1） were significantly decreased（P<0.05）. Compared with the model group， the protein exprsssions of BDNF of paeoniflorin group（30 mg·kg-1） and albiflorin group（30 mg·kg-1） were obviously increased（P<0.05）. Albiflorin and paeoniflorin have the effects of smooth the liver and dispel stagnation， the mechanism has the relevant with adjusting and controlling the expression of NO and BDNF in hippocampus.

[Key words] albiflorin； paeoniflorin； liver stagnation syndrome； nitric oxide； brain derived neurotrophic factor

doi：10.4268/cjcmm20162225

白芍[1]为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，味苦、酸，微寒，归肝、脾经，养血敛阴，柔肝止痛。赤芍[1]为毛茛科植物芍药P. lactiflora Pall.或川赤芍P. veitchii Lynch的干燥根，味苦、微寒，归肝经，清热凉血，散瘀止痛。白芍与赤芍来源相似，都含有芍药苷、芍药内酯苷等单萜苷类成分[2]，研究表明芍药内酯苷、芍药苷具有补血、抗应激作用[39]。本实验通过芍药内酯苷和芍药苷对束缚应激致肝郁大鼠药理作用以及对海马脑源性神经营养因子（BDNF）以及NO的研究，探讨白芍特征成分芍药内酯苷与赤芍与白芍的共同有效成分芍药苷的作用机制及特点。

1 材料

1.1 动物 雄性Sprague Dawley大鼠，体重（180±20） g，由北京维通利华实验动物有限公司提供，合格证号SCXK（京）20160002。

1.2 药品 实验用芍药内酯苷、芍药苷均为自制，纯度均高于96%。氟西汀购自PATHEON FRANCE，产品批号5169A（分包装厂礼来苏州制药有限公司，分包装批号5169AA）。逍遥丸（浓缩丸）购自九芝堂股份有限公司，产品批号201510006，经本实验室HPLC测定，本品芍药苷质量分数为4.19 mg·g-1，芍药内酯苷质量分数为2.68 mg·g-1。

1.3 仪器与试剂 大鼠不锈钢束缚器：筒长20 cm、内径6 cm，可通过移动底板调节其长度；大鼠行为学观察敞箱（自制）；荧光定量PCR仪（ABI，批号7300）；Trizol 试剂（Invitrogen Life Technologies，批号15596026）；紫外分光光度计（上海现科仪器有限公司，批号752P）；RIPA裂解液（武汉谷歌生物科技公司，批号G2002）；HRP标记山羊抗兔（武汉谷歌生物科技公司，批号GB23303）；HRP标记驴抗山羊（武汉谷歌生物科技公司，批号GB23404）；HRP标记山羊抗小鼠（武汉谷歌生物科技公司，批号GB23301）；HRP标记山羊抗大鼠（武汉谷歌生物科技公司，批号GB23302）。

2 方法

2.1 分组与给药 将80只SD大鼠随机分成8组，即空白组、模型组、氟西汀组（2.0 mg·kg-1，相当于人用量15 mg·d-1）、逍遥丸组（4.032 g·kg-1，相当于逍遥丸中白芍人用量4.32 g·d-1，相当于芍药苷18.1 mg·d-1、芍药内酯苷11.6 mg·d-1）、芍药内酯苷组（30，15 mg·kg-1）、芍药苷组（30，15 mg·kg-1），每组10只。持续给药21 d，按每100 g体重灌胃1 mL给药，每日1次。空白组、模型组每天灌胃等量蒸馏水。

2.2 造模方法 动物适应数天后[10]，除空白组每笼5只常规饲养外，剩余大鼠进行常规单笼适应性喂养5 d。除空白组外，各组大鼠进行孤养结合束缚应激模型复制：将大鼠放入自制筒长为20 cm、内径为6 cm，并可以调节长度的不锈钢束缚器中；以不影响大鼠正常昼夜节律为前提，可通过移动束缚筒内底板的位置，使大鼠无损伤完全固定，限制大鼠进退和掉头，以不产生压迫感、不影响呼吸和排泄为度。每天定时束缚3 h（8：00—11：00 am），连续3周。

2.3 样品处理 实验第22天，SD大鼠快速断头处死后迅速取出脑组织，在超净台冰面上分离出海马组织，置于灭菌冻存管，液氮中保存待用。

2.4 体征观察与体重检测 观察大鼠的口唇、眼睛、皮毛、尾巴的颜色、精神状态等变化；并于第1，7，14，21天称重，记录并分析各组大鼠体重变化。

2.5 糖水消耗试验 在实验前48 h，对所有的大鼠进行1%蔗糖水摄取训练；随后断水断食24 h，进行第1次糖水消耗量基线测定；于实验的第7，14，21天分别于8：00—11：00 am测定大鼠1 h内的蔗糖水摄取量，最后计算糖水消耗量=糖水消耗量（mL）/（去离子水+糖水消耗量）（mL）。

2.6 敞箱试验 敞箱为本实验室自制。大鼠行为学观察敞箱（40 cm×80 cm×80 cm）无盖，周壁和箱底均为黑色，底面划分面积相等的25块方格，用白线划分。本实验[11]于在末次处理的1 h后，在安静、四周由遮光帘隔离的独立操作室里进行。操作者带黑色手套，握住大鼠尾根部1/3处，小心放入敞箱正中格，释放后观察5 min的活动情况。并注意每只结束后，用毛巾蘸清水及低浓度乙醇彻底清理敞箱，待其气味挥发扩散后，再进行下一只的测试。测定指标包括：①正中央格停留时间；②方格间穿行次数（三爪以上跨入邻格的次数）；③竖起或修饰次数（前两肢离地1 cm以上的次数）；④竖起或修饰时间（前两肢离地1 cm以上的时间，包括前肢向上抬举、抓痒、洗脸、舔足等）。

2.7 格里斯法（Griess法）测定海马组织中NO含量 用一氧化氮测试盒进行NO含量测定，其原理是用硝酸还原酶法先将NO3-还原成NO2-，再用Griess法反应测定NO2-总量。即在弱酸性条件下，NO2-与对氨基苯磺酸重氮化后，与N1萘基乙二胺偶合形成红色燃料，用比色法可测得NO2-总量，从而得出各组大鼠海马组织中NO含量。

2.8 酶免法测定海马组织中BDNF含量 采用ELISA法检测BDNF，每一份样本进行双点测定， 严格按说明书进行操作。STAT FAX 2100全自动酶标仪检测BDNF含量。

2.9 实时荧光定量聚合酶链式反应法（RTqPCR）检测海马中nNOS mRNA表达 每组取4只大鼠海马组织按Trizol试剂说明抽提总RNA。取2 μg总RNA为模板，加入1 μL Oligo（dT）18和无核糖核酸酶的去离子水后于PCR仪上70 ℃保温5 min，迅速置冰上冷却，依次加入4 μL 5×buffer，10 mmol·L-1 dNTPs 2 μL，1 μL RNA inhibitor和1 μL反转录酶，于PCR仪上42 ℃保温60 min，结束后80 ℃保温5 min灭活反转录酶。取0.2 mL PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管：2× qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol·L-1基因引物2.0 μL，反转录产物2.5 μL，蒸馏水8.0 μL。取0.2 mL PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管：2× qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol·L-1内参引物2.0 μL，反转录产物2.5 μL，蒸馏水8.0 μL。PCR扩增预变性，95 ℃10 min；循环（40次）95 ℃，15 s到60 ℃，60 s；溶解曲线75 ℃到95 ℃，每20 s升温1 ℃。PCR反应及数据采集在LightCycler 2.0系统上进行，记录其循环阈值（CT），基因表达结果采用相对定量公式2ΔΔCt计算，其中ΔCt值=靶基因的Ct值-βactin的Ct值。测定海马组织中nNOS mRNA表达水平。

引物设计使用Primer 3.0 软件计算机辅助设计，见表1。

2.10 蛋白质印迹法（Western blot）检测海马中nNOS以及BDNF的蛋白表达 每组取5只大鼠海马组织。冰浴30 min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。裂解30 min后，移至离心管，在4 ℃下12 000 r·min-1离心5 min，收集上清，即为总蛋白溶液。再按照常规Western blot方法操作，以βactin蛋白表达水平作为内参，以各样本与相应内参灰度值比值为蛋白相对含量。

2.11 数据处理 数据用±s表示，采用SPSS Statistics 20.0的IndependentSample T Test或Oneway ANOVA过程（两两比较采用SNK）进行统计学分析，以P<0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 芍药内酯苷和芍药苷对肝郁大鼠体重的影响 与空白组比较，模型组体重从第7天开始明显降低，差异非常显著（P<0.001），从第21天开始，与模型组相比，逍遥丸组体重明显升高，差异显著（P<0.01）；氟西汀组体重明显升高（P<0.05）；芍药苷30 mg·kg-1组、芍药苷15 mg·kg-1组的体重明显升高（P<0.01，P<0.05）；芍药内酯苷30 mg·kg-1组、芍药内酯苷15 mg·kg-1组的体重明显升高（P<0.05，P<0.01），见表2。

3.2 芍药内酯苷和芍药苷对肝郁证大鼠糖水消耗的影响 与空白组比较，模型组糖水消耗量从第21天开始明显降低（P<0.001）；与模型组相比，各药物组糖水消耗量有升高趋势，但无明显统计学差异，见表3。

3.3 芍药内酯苷和芍药苷对肝郁证大鼠敞箱自发活动的影响 与空白组比较，模型组修饰次数明显降低（P<0.05）；与模型组相比，各给药组具有升高趋势，但无统计学差异；与空白组比较，模型组穿行次数明显降低，差异显著（P<0.01）；与模型组相比，逍遥丸组穿行次数明显升高，差异显著（P<0.01）；氟西汀组穿行次数明显升高，差异显著（P<0.01）；芍药苷30 mg·kg-1组的穿行次数明显升高（P<0.05）；芍药内酯苷30 mg·kg-1组的穿行次数明显升高，差异显著（P<0.01）；与空白组比较，模型组滞留时间明显升高（P<0.05）；与模型组相比，逍遥丸组滞留时间明显降低（P<0.05）；氟西汀组

滞留时间明显降低，差异显著（P<0.01）；芍药苷30，15 mg·kg-1组的滞留时间明显降低（P<0.01，P<0.05）；芍药内酯苷30，15 mg·kg-1组的滞留时间明显降低，差异显著（P<0.01，P<0.01），见表4。

3.4 芍药内酯苷和芍药苷对肝郁证大鼠海马组织中NO含量的影响 与空白组比较，模型组NO含量明显升高，差异显著（P<0.01）；与模型组相比，逍遥丸组NO水平明显降低（P<0.05）；氟西汀组NO水平明显降低，差异显著（P<0.01）；芍药苷30，15 mg·kg-1组的NO水平明显降低（P<0.05，P<0.01）；芍药内酯苷30，15 mg·kg-1组的NO水平明显降低（P<0.05，P<0.05），见表5。

3.5 芍药内酯苷和芍药苷对肝郁证大鼠海马组织中BDNF含量的影响 与空白组比较，模型组BDNF含量明显降低，差异显著（P<0.01）；与模型组相比，逍遥丸组BDNF水平明显升高，差异显著（P<0.01）；氟西汀组BDNF水平明显升高，差异显著（P<0.01）；芍药苷30 mg·kg-1组与芍药内酯苷30 mg·kg-1组的BDNF水平明显升高（均P<0.05），见表6。

3.6 芍药内酯苷和芍药苷对肝郁证大鼠海马组织中nNOS mRNA表达的影响 与空白组比较，模型组nNOS mRNA表达明显升高，差异非常显著（P<0.001）；与模型组相比，逍遥丸组与氟西汀组nNOS mRNA表达明显降低（P<0.05，P<0.05）；芍药苷30，15 mg·kg-1组的nNOS mRNA表达明显降低，

3.7 芍药内酯苷和芍药苷对肝郁证大鼠海马组织中nNOS 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组nNOS 蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组相比，各药物组nNOS 蛋白表达有降低趋势，但无明显统计学差异，见表8。

3.8 芍药内酯苷和芍药苷对肝郁证大鼠海马组织中BDNF 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组BDNF 蛋白表达明显降低，差异显著（P<0.01）；与模型组相比，逍遥丸组、氟西汀组、芍药苷30 mg·kg-1组、芍药内酯苷30 mg·kg-1组的BDNF 蛋白表达明显升高（P<0.05），见表9。

4 讨论

肝郁，中医认为是一种情志相关疾病，常见于现代医学中的精神神经类疾病，与慢性应激引起的抑郁症相似[12]。采用慢性轻度不可预知应激（CUMS）大鼠模型和嗅球损毁抑郁大鼠模型对白芍提取物（芍药苷48.89%和芍药内酯苷18.99%）及白芍有效成分芍药苷进行研究，发现白芍提取物与芍药苷均具有良好的抗抑郁作用，且机制与调节大脑皮层单胺类神经递质和NO/cGMP通路有关[1316]。

本实验采用目前被广泛应用的慢性束缚应激结合孤养方法复制大鼠肝郁模型[10]。从第7天开始，大鼠体重开始急剧下降，出现毛发凌乱、色泽晦暗、喜蜷伏角落，灌胃时反抗剧烈、撕叫挣扎等现象，与肝郁证临床表现特点相一致。从14 d开始，大鼠兴奋性持续降低、探究兴趣减弱，体重增长缓慢，但各给药组与模型组之间并未出现统计学差异。第21天模型组、给药组大鼠体重出现增长差异，糖水消耗量，行为学旷场实验中穿行次数、修饰时间、滞留时间明显变化。

本实验以逍遥丸和氟西汀为阳性对照药。氟西汀作为一种选择性5羟色胺再摄取抑制剂类（SSRI）抗抑郁药，常用于临床治疗抑郁症[17]。逍遥丸作为传统中医名方，出自宋代《太平惠民和剂局方》，由柴胡、白芍、当归、白术（炒）等组成，具有疏肝解郁，养血健脾之效。经HPLC检测本次使用逍遥丸中芍药内酯苷及芍药苷质量分数分别为10.80，16.89 mg·kg-1。表明在本实验给药剂量下，逍遥丸中芍药内酯苷及芍药苷含量与本实验二者的给药剂量相近。

海马作为与情感疾病相关的大脑边缘系统构成组织之一，在学习、记忆、情绪、内分泌、内脏活动及介导应激反应中发挥重要作用[18]。一氧化氮参与抑郁症的发病过程，抑郁症患者血清及脑内一氧化氮升高，一氧化氮合酶及NMDA 受体拮抗剂对抑郁症治疗有效[19]。研究表明，NO作为一种神经信号的传递物质， 可以促进脑部的血流量，并可能与脑细胞的发育、脑细胞的学习和记忆过程、后脑垂体激素如血管加压素和催产素的分泌、保护脑细胞避免毒物的攻击及脑缺血时调整脑血供应等有关[20]。在本模型条件下，NO升高的原因可能与慢性应激激活下丘脑垂体肾上腺（HPA）轴，糖皮质激素持续高分泌以及脑内兴奋性氨基酸含量增多有关[21]，芍药内酯苷、芍药苷均可以降低慢性束缚应激大鼠海马NO含量水平。

神经元一氧化氮合酶（nNOS）是内源性的通过催化底物左旋精氨酸分解产生一氧化氮的一氧化氮合酶之一[18]。nNOS 已经被证实是海马中神经元再生的抑制分子，研究表明nNOS是介导氟西汀影响神经元再生进而影响抑郁行为的关键分子[17]。本实验芍药苷、芍药内酯苷对nNOS蛋白表达的影响却并不明显，这可能与NO对抑郁症具有双向作用有关，原因有待深入研究。

“神经营养假说”认为，人类的抑郁障碍与脑源性神经营养因子（BDNF）的表达降低及功能下调有关，临床上对抑郁症的治疗可通过提高脑内神经生长因子水平抵抗应激引起的脑组织损伤[22]，它可能参与了抑郁症的发病和治疗机制，并可能与抑郁症的预后密切相关。而另一方面，NO又能控制长期突触改变中的早期基因如BDNF等表达，使树突减少、突触终端结构改变、神经可塑性降低， 从而导致以海马为重要组成部分的情感调节中枢功能失常[1920]。本实验芍药苷、芍药内酯苷增强海马中BDNF 水平以及表达。

综述以上结果，在本实验条件下，芍药内酯苷、芍药苷能够通过增加大鼠体重、提高大鼠自主活动和探索行为、降低紧张度和对新环境恐惧等方面改善大鼠抑郁样作用；其机制与调节海马内NO含量以及BDNF的表达有关。

[致谢] 北京中医药大学科研实验中心李伟老师对本实验提供了支持。

[参考文献]

[1] 中国药典.一部[S].2015：105.

[2] 张建军，李伟，王丽丽，等. 赤芍和白芍品种、功效及临床应用述评[J].中国中药杂志，2013，38（20）：3601.

[3] 张建军，黄银峰，王丽丽，等. 白芍、赤芍及芍药苷、芍药内酯苷对综合放血法致血虚小鼠补血作用的比较研究[J].中国中药杂志，2013，38（19）：3358.

[4] 屈胜胜，张建军，黄银峰，等. 芍药苷、芍药内酯苷对放射线辐照法致血虚小鼠的补血作用[J].中国中药杂志，2014，39（15）：2952.

[5] 朱映黎，张建军，黄银峰，等. 白芍和赤芍对环磷酰胺致血虚小鼠的补血作用及对IL3、TNFα影响的比较研究[J].中华中医药杂志，2014，29（4）：1060.

[6] 朱映黎，张建军，王景霞，等. 芍药内酯苷和芍药苷对环磷酰胺致血虚小鼠的补血作用及对GMCSF，IL3，TNFα影响的比较研究[J].中国中药杂志，2015，40（2）：333.

[7] 朱映黎，王林元，王景霞，等. 芍药内酯苷对环磷酰胺致血虚小鼠的补血作用及机制[J]. 中华中医药杂志，2016，31（5）：1896.

[8] 朱映黎，王林元，赵丹萍，等. 芍药内酯苷、芍药苷对血虚免疫抑制小鼠的补血作用及机制[J]. 北京中医药大学学报，2016，39（3）：207.

[9] Zhu Y， Wang L， Yang Z， et al. Hematopoietic effects of paeoniflorin and albiflorin on radiotherapyinduced myelosuppression mice[J]. Evidbased Complement Alternat， 2016， 2016（15）：8.

[10] Liu Lanxiang， Zhou Xinyu， Zhang Yuqing， et al. The identification of metabolic disturbances in the prefrontal cortex of the chronic restraint stress rat model of depression[J]. Behav Brain Res，2016，305：156.

[11] 王天芳，陈易新，季绍良，等.慢性束缚致慢性疲劳动物模型的研制及其行为学观察[J].中国中医基础医学杂志，1995，5（5）：29.

[12] 陈家旭，杨维益.神经内分泌免疫网络研究概况及其与中医肝脏关系的探讨[J].北京中医药大学学报，1995，18（4）：11.

[13] 王景霞，张建军，李伟，等.白芍提取物对慢性应激抑郁模型大鼠行为学及大脑皮层单胺类神经递质的影响[J].中华中医药杂志，2010，25（11）：1897.

[14] 王景霞，张建军，苗春平，等.白芍提取物对嗅球损毁抑郁模型大鼠行为学及下丘脑垂体肾上腺轴的影响[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（3）：158.

[15] 王景霞，张建军，李伟，等.白芍提取物治疗抑郁症的实验研究的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（7）：184.

[16] 王景霞，张建军，李伟，等.芍药苷抗抑郁作用与NO/cGMP通路相关性研究[J].中药与临床，2012，3（1）：28.

[17] 吴海银，张晶. 海马神经元型一氧化氮合酶神经元再生通路介导5羟色胺类抗抑郁药作用[J]. 中国临床药理学与治疗学，2013，18（3）：257.

[18] Santarelli L， Saxe M， Gross C， et al. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants[J]. Science， 2003， 301（5634）：809.

[19] 李欣，周虹，杨宝学. 一氧化氮与抑郁症发生的相关性[J]. 国际神经病学神经外科学杂志，2010，37（4）：356.

[20] 王景霞，刘妍，张建军. 一氧化氮与抑郁症[J]. 现代医学，2011，39（1）：107.

[21] 李惠春，陈巧珍，钱烈. 慢性应激抑郁模型大鼠脑内一氧化氮含量的变化[J]. 浙江大学学报：医学版，2007，36（2）：154.

[22] 尹烈虎，李学成，陆地，等. 抑郁模型大鼠脑脊液、海马和皮层组织脑源性神经营养因子的变化[J]. 第三军医大学学报，2009，31（3）：232.

[责任编辑 张燕]