鸦胆子蛋白质组成分析及其酶解物细胞毒性研究

冀会方　刘露　李开　张月圆　王灵芝

[摘要] 对鸦胆子进行蛋白质组成分析，并对其球蛋白酶解物细胞毒性进行研究。采用顺序抽提法提取鸦胆子清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4类蛋白组分，并用凯氏定氮法进行定量；采用不同种蛋白酶水解鸦胆子球蛋白，MTT法考察其小分子量（≤3 kDa）酶解物对人乳腺癌MCF7的细胞毒性。结果表明：鸦胆子总蛋白含量为17.47%，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和残渣蛋白分别占总蛋白含量的15.01%，8.11%，2.47%，44.92%，23.62%；球蛋白的胃蛋白酶酶解物（≤3 kDa）对人乳腺癌MCF7具有显著的细胞毒性，且作用72 h后，IC50为（6.52±0.01） mg·L-1。鸦胆子蛋白质含量较为丰富，其多肽组分具有明确的体外细胞毒性，可进一步开发抗肿瘤活性成分。

[关键词] 鸦胆子； 蛋白质； 抗肿瘤多肽

Protein composition analysis and cytotoxicity of gulbulin

hydrolysates of Brucea javanica seeds

JI Huifang， LIU Lu， LI Kai， ZHANG Yueyuan， WANG Lingzhi*

（School of Chinese Material Medica， Beijing University of Chinese medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] To analyze the protein composition of Brucea javanica seeds and evaluate the cytotoxicity of its gulbulin hydrolysates. Four protein fractions of albumin， gulbulin， prolamin and glutelin were sequentially extracted and then quantified by Kjeldahl method. Different kinds of proteases were applied to hydrolyze B.javanica gulbulin， and MTT assay was used to evaluate the cytotoxicity of low molecular weight hydrolysates （≤3 kDa） on human breast cancer MCF7 cell. The results showed that： the total protein content of B.javanica seeds was 17.47%， albumin， gulbulin， coxin， glutelin and residue protein accounted for 15.01%， 8.11%， 2.47%， 44.92% and 23.62% of the total protein content， respectively. The hydrolysates （≤ 3 kDa） of B.javanica globulin produced by pepsin showed significant growth inhibitory activity on MCF7 cells， and the IC50 value was（6.52±0.01） mg·L-1 after 72 h of incubation. Protein was abundant in B.javanica seeds， and its peptides demonstrated specific cytotoxicity on MCF7 cell line in vitro， suggesting antitumor active ingredient can be further generated from B.javanica seeds.

[Key words] Brucea javanica seeds； protein； antitumor peptides

doi：10.4268/cjcmm20162221

鸦胆子为苦木科鸦胆子属植物鸦胆子Brucea javanica（Linnaeus）Merrill的干燥成熟果实，又名老鸦胆、苦参子和鸦蛋子，主产于我国广东、广西、海南、云南、福建和台湾等地[1]。鸦胆子味苦、性寒、有微毒，归大肠、肝经，有清热、解毒、截疟、止痢和腐蚀赘疣等功效[2]，并具有较强的抗疟、抗炎、抗病毒作用[3]。现代研究表明，鸦胆子含有多种药理活性物质，如脂肪酸及酯类、苦木素类、三萜类、生物碱、黄酮等，具有良好的抗肿瘤[4]、抗消化道溃疡[5]、降血脂[6]功能。鸦胆子的石油醚提取物——鸦胆子油，已被开发为多种剂型，应用于临床治疗多种恶性肿瘤[7]。

蛋白质作为生命结构和功能的重要组成部分，具有重要研究价值，目前已进行了多种植物种子蛋白的广泛研究。种子储藏蛋白根据其溶解特性可分为四大类：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[8]。 生物肽是对生物体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，而生物肽多以非活性状态存在于蛋白质长链中，经适当的蛋白酶水解释放后，显示出广泛的生物学特性[9]。目前已有大量关于玉米、大豆、红松、苜蓿等种子储藏蛋白的研究，并获得了具有多种药理活性的功能肽。但是，国内外关于鸦胆子蛋白质组成及其活性研究的报道较少，因此，本文对鸦胆子的蛋白质组成做了较为系统的分析，并初步探究了鸦胆子球蛋白酶解物的细胞毒性，为进一步开发抗肿瘤活性成分提供了理论依据。

1 材料

鸦胆子（产地广西，批号20100242）购于北京同仁堂，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为苦木科鸦胆子属植物鸦胆子B. javanica的干燥成熟果实。

人乳腺癌MCF7细胞，获赠于北京中医药大学孙震晓教授。

木瓜蛋白酶（批号20140922，北京拜尔迪生物技术有限公司）；α糜蛋白酶（批号1000916140，Sigma公司）；风味蛋白酶（批号1001125310，Sigma公司）；嗜热菌蛋白酶（批号1001229949，Sigma公司）；胃蛋白酶（批号101644990，Sigma公司）；胰蛋白酶（批号1002203482，Sigma公司）；RPMI1640 培养基（批号1493423，Gibco公司）； 胎牛血清（Gibco公司）；双抗（批号1734042，Gibco公司）； 蛋白质标准品（批号20160422，北京拜尔迪生物技术有限公司）；蛋白质上样缓冲液（批号20160422，北京拜尔迪生物技术有限公司）；其他试剂均为分析纯。

FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；DHG9053A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；BP221S型电子分析天平（Sartorius公司）；TGL20M型台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；SRJX413 型高温电阻炉（北京市永光明医疗仪器长）；WXG4型旋光仪（上海申光仪器仪表有限公司）；日立L8900全自动氨基酸分析仪（日立高新技术公司）；FD50冷冻干燥机（上海比朗仪器制造有限公司）；DF101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；FLC3超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；MCO18AIC（UV）CO2培养箱（日本SANYO 公司）；Epoch酶标仪（美国BioTek 公司）；TE2000S倒置显微镜（日本NIKON公司）。

2 方法

2.1 鸦胆子蛋白质组成研究

2.1.1 鸦胆子蛋白质的顺序抽提 采用顺序抽提法[10]依次提取鸦胆子的4类蛋白组分。鸦胆子粉末经石油醚脱脂，真空干燥后，依次用双蒸水、5% NaCl溶液、70%乙醇和0.1 mol·L-1 NaOH溶液顺序抽提清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，固液比为1∶10。其中，清蛋白和球蛋白于4 ℃提取，醇溶蛋白和谷蛋白于室温提取。每种蛋白组分振荡抽提1 h，1万 r·min-1离心20 min，收集上清液，重复操作1次，离心后的沉淀用来进行下一蛋白组分的提取。

2.1.2 SDSPAGE 采用垂直板不连续体系[11] 分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为 5%。蛋白溶液加入上样缓冲液后，100 ℃变性5 min，上样量20 μg，室温恒压电泳。当溴酚蓝指示剂距胶底5 mm时，停止电泳。考马斯亮蓝R250染色。

2.1.3 鸦胆子主要成分含量测定 蛋白质含量测定采用凯式定氮法 [12]：鸦胆子粉碎为粉末，过40目筛。精密称定粉末样品或量取顺序抽提的蛋白质溶液于凯氏烧瓶中，然后依次加入浓硫酸（95%～98%）和催化剂（K2SO4CuSO4·5H2O 5∶1）置于热源上消化，直至消化终点。将定容后的消化液蒸馏，并用0.005 mol·L-1的稀硫酸进行滴定。每个样品重复3次实验。

粉末样品中蛋白质含量=（A-B）×0.140 1×6.25×N/（C×1 000）×100%

液体样品中蛋白质含量（mg）=（A-B）×0.140 1×6.25×N

A为滴定样品用去的稀硫酸平均体积（mL），B为滴定空白样品用去的稀硫酸平均体积（mL），6.25 为系数，N为样品的稀释倍数，C为粉末样品的质量（g）。

淀粉含量测定[13]：精密称取（2.50±0.05）g鸦胆子粉末，平行6份，烘干。其中3份样品中加入稀盐酸，并进行加热，使淀粉水解为可溶性糖，然后加入硫酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液沉淀非糖类物质，过滤，取滤液测定总旋光度值α1。同时，使用乙醇提取另外3份样品中的可溶性糖及低分子量多糖，测定其旋光度值α2。将α1、α2带入以下公式计算即得淀粉含量。

淀粉含量=100×（α1-α2）[α]20D·L·W×100%

[α]20D：纯淀粉的比旋光度；L：旋光管长度（dm）；W：样品质量（g）。

粗脂肪含量测定[14]：精密称取（3.50±0.05） g鸦胆子于已干燥至恒重的滤纸筒内，烘干，放冷后精密称定，平行3份，在索式提取器内使用石油醚90℃回流8～10 h后，烘干，放冷后再次精密称定样品质量。2次称量的差值即为粗脂肪含量。

灰分含量测定[12]：精密称取鸦胆子（2.00±0.01） g至已炽热恒重的坩埚内，精密称定，平行3份，500～600 ℃缓缓炽热至完全炭化，移至干燥器中，放冷，精密称定后，再次500～600 ℃炽热至恒重，即得灰分含量。

水分含量测定[12]：取供试品（5.00±0.05） g平铺于干燥恒重的称量瓶中，精密称定，平行3份，开启瓶盖于105 ℃干燥5 h，放冷后精密称定，再次重复，直至相邻2次称重差异不超过5 mg为止，根据减失的质量，计算水分含量。

2.1.4 氨基酸含量分析 精密称定样品粉末，平行3份，溶于 6 mol·L-1 HCl，110 ℃真空水解24 h。将蛋白质酸水解液用过甲酸处理，水解产物真空干燥后溶于适量0.02 mol·L-1 HCl，日立 L8900 测定氨基酸含量[15]。同时，色氨酸和胱氨酸在含量测定前分别采用碱水解法[16]和过甲酸氧化法[17]进行测定。

2.2 鸦胆子球蛋白酶解物的细胞毒性研究

球蛋白是重要的种子储藏蛋白之一，根据沉降系数的不同可分为2S，7S，11S和15S球蛋白，且每一种球蛋白都由不同数量的亚基构成，因而形成种类繁多且功能多样的球蛋白[18]。课题组前期研究表明球蛋白组分蛋白质量较高（79.69%），因此，选择球蛋白作为后续实验的研究对象。

2.2.1 最优蛋白酶的筛选 球蛋白提取液经透析（MWCO：35 kDa）纯化后，进行冷冻干燥。将冻干蛋白粉分别用木瓜蛋白酶、α糜蛋白酶、风味蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶进行水解，底物浓度0.5%，酶与底物浓度比1∶10。选择各种酶的最适宜反应条件：木瓜蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl缓冲液，pH 8.0，65 ℃），α糜蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl缓冲液，pH 8.0，37 ℃），风味蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl缓冲液，pH 7.0，65 ℃），嗜热菌蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl缓冲液，pH 8.0，65 ℃），胃蛋白酶（0.01 mol·L-1 HCl，pH 2.0，37 ℃）和胰蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl缓冲液，pH 8.0，37 ℃）。水解液振荡水浴48 h后，95 ℃变性5 min终止反应，冰浴10 min，1万 r·min-1，4 ℃离心20 min，取上清液，超滤离心（MWCO：3 kDa），收集滤过液，冷冻干燥后，采用PBS配制质量浓度为10 g·L-1的药物母液，过滤除菌，备用。

2.2.2 酶解产物（≤3 kDa）对人乳腺癌MCF7的细胞毒性研究 取处于对数生长期的人乳腺癌MCF7细胞，调整细胞密度为2×104个/mL，按100 μL/孔接种于96孔培养板。贴壁培养12 h后，弃去培养液，阴性对照组每孔加入150 μL新鲜培养基，阳性对照组每孔加入等体积5 mg·L-1 5FU。其余各组每孔加入等体积不同浓度的酶解产物，继续培养72 h，每组6个复孔。孵育72 h后，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1）孵育 4 h，弃去上清，每孔加 150 μL DMSO，低速振荡 10 min，酶标仪 570 nm波长测定吸光度（A），计算细胞增殖抑制率，并计算 IC50。每组实验重复3次。

抑制率=（1-A实验组/A对照组） ×100%

2.3 统计学方法

所有实验数据均用±s表示，采用SAS 9.3 进行单因素方差分析，P<0.05表示具有显著性差异。

3 结果

3.1 鸦胆子主要成分含量测定

鸦胆子主要成分分析， 总蛋白量为（17.47±0.12）%，淀粉量为（49.26±0.02）%，粗脂肪、灰分和水分的量分别为（16.16±0.13）%，（5.61±0.10）% 和（6.74±0.05）%。

3.2 鸦胆子蛋白质组成研究

3.2.1 鸦胆子蛋白质组分分析 采用顺序抽提法依次用双蒸水、5% NaCl溶液、70%乙醇和0.1 mol·L-1 NaOH溶液提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，经 SDSPAGE电泳后，电泳图谱见图1。清蛋白电泳条带最少，仅在28 kDa附近有分布；球蛋白条带相对较多，主要分布在33，28，19，10 kDa附近；醇溶蛋白条带也较多一些，主要分布在27， 22，14，10 kDa附近；谷蛋白相对分子质量分布较为广泛，条带也存在明显差异，但主要分布范围为37 kDa和17～20 kDa。对4类蛋白定量分析，醇溶蛋白量为每100 mg鲜重（0.43±0.01）mg，占鸦胆子总蛋白的2.47%，含量最低；其次为球蛋白为每100 mg鲜重（1.42±0.01）mg，占总蛋白质量的 8.11%。清蛋白含量较高，占鸦胆子总蛋白的15.01%。4类蛋白中，含量最高的谷蛋白，其绝对量为每100 mg鲜重（7.87±0.02）mg和相对量为44.92% 。此外，仍有23.62%的蛋白质存在于残渣。

3.2.2 鸦胆子氨基酸组成分析 采用酸水解法，并结合碱水解及过甲酸氧化法，进行100 mg鸦胆子样品氨基酸含量测定，共检测到18种氨基酸，总量为11.06 mg，其中含量最高的是Glu， 为 1.88 mg，其次是Asp，为 1.85 mg。人体所需的10种必需氨基酸和半必需氨基酸均被检测到Thr， Val， Met， Ile， Leu， Phe， Lys， His， Arg， Trp， 量分别为 0.35， 0.53， 0.11， 0.46， 0.78， 0.52， 0.37， 0.35， 0.79， 0.08 mg， 见表3。

3.3 鸦胆子球蛋白酶解物细胞毒性研究

3.3.1 最优蛋白酶的筛选 采用MTT实验考察球蛋白的不同酶解产物（≤3 kDa）对人乳腺癌MCF7的细胞毒性，结果见图2，在药物浓度为10 mg·L-1时，球蛋白的胃蛋白酶酶解产物（≤3 kDa）对MCF7细胞的增殖抑制活性最强，高达75%，因此，确定胃蛋白酶为酶解鸦胆子球蛋白的最优酶。

3.3.2 胃蛋白酶酶解物（≤ 3 kDa）的细胞毒性 分别对加药后24， 48， 72 h不同浓度组的MCF7细胞进行显微观察，见图3。阴性对照组随着培养时间的延长，细胞数目逐渐增多，且形态基本保持不变，为不规则多边形。阳性对照组的细胞随着时间的延长，细胞数目逐渐减少，细胞形态逐渐皱缩，并裂解为细胞碎片。在同一药物浓度下，如7 mg·L-1时，随着时间的延长，细胞数目逐渐减少，细胞形态逐渐由不规则多边形变成圆形，细胞逐渐破碎；在相同时间下，如48 h，随着药物浓度的增加，细胞数目逐渐减少，变形细胞数目及细胞碎片也渐渐增多。

4 讨论

鸦胆子为我国传统中药，研究工作者已从中分离得到多种抗肿瘤活性成分，如油酸、亚油酸、鸦胆子苦素、鸦胆子苷等。然而，有关鸦胆子蛋白质及其多肽的研究却鲜少报道。2013年，Sornwatana T等[19]采用胃蛋白酶水解鸦胆子蛋白质，从中获得了11肽Brucin，可有效抑制化脓性链球菌引起的感染（MIC 20 mmol·L-1）。因此，为考察鸦胆子多肽类成分是否也具有抗肿瘤活性，本研究采用顺序抽提法对鸦胆子蛋白质进行了较为系统的分析，结果表明鸦胆子蛋白质含量较丰富（17.47%）且含有18种氨基酸，采用酶解法初步获得了对MCF7细胞株具有较高增殖抑制活性的多肽组分。

酶解法制备生物肽，具有生产条件温和、安全性高和易得性等优点[20]，显著优于传统的化学水解法，已得到广泛应用。球蛋白作为种子的重要储藏蛋白之一，其研究逐渐受到重视，目前已有大量关于大豆、燕麦、小麦和花生等种子球蛋白及其酶解产物的研究。蔺瑞等[21]采用Osborne法提取裸燕麦球蛋白，并利用盐析、SephadexG100 凝胶过滤色谱等方法进一步纯化，发现组分Ⅰ显示出更强的抗氧化能力。丁秀臻等[22]研究发现，与未还原大豆球蛋白酶解物相比，还原大豆球蛋白酶解物具有更强的抗氧化能力及与Hg2+的结合能力。侯文娟等[22]采用碱性蛋白酶水解荞麦球蛋白，酶解产物经凝胶柱色谱分离得到的相对分子质量小于1 kDa 的组分显示出较强的抗氧化能力。本研究对鸦胆子球蛋白的水解酶进行了筛选，发现其胃蛋白酶酶解产物（≤ 3 kDa）对人乳腺癌MCF7细胞具有出良好的体外抗肿瘤活性IC50 （6.52±0.01）mg·L-1。为进一步获得高活性的抗肿瘤多肽组分或单体，将采用凝胶过滤色谱、高效液相色谱等多步色谱分离技术对酶解产物进行分离纯化，并进行深入机制探讨。

综上所述，鸦胆子多肽类组分具有显著的抑制肿瘤细胞增殖作用，为该药临床应用和药效物质基础研究提供了新的实验数据。

[参考文献]

[1] 赵学敏. 本草纲目拾遗[M]. 北京： 中国中医药出版社， 2007：131.

[2] 中国药典. 一部[S]. 2015.

[3] Chen Meiwan， Chen Ruie， Wang Shengpeng， et al. Chemical components， pharmacological properties， and nanoparticulate delivery systems of Brucea javanica [J]. Int J Nanomed， 2013， 8（1）： 85.

[4] Yan Zheng， Zhang Bei， Huang Yuanyuan， et al. Involvement of autophagy inhibition in Brucea javanica oil emulsioninduced colon cancer cell death [J]. Oncol Lett， 2015， 9（3）： 1425.

[5] 袁佩英. 鸦胆子乳剂抑制幽门螺杆菌的临床研究[J]. 山西中医， 1992， 8（6）： 20.

[6] 于晓光， 王淑娟， 张雪峰， 等. 高脂血症沙鼠组织中某些酯酶活性的变化及药物降脂作用的研究[J]. 哈尔滨医科大学学报， 1997， 31（1）： 12.

[7] Zhang Hong， Yang Jingyu， Zhou Fan， et al. Seed oil of Brucea javanica induces apoptotic death of acute myeloid leukemia cells via both the death receptors and the mitochondrialrelated pathways[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2011， 2011： 965016.

[8] Chen L， Fischer H， Jensen U， et al. Accumulation of seed storage proteins and taxonomy of Poaceae[J]. Pl Syst Evol， 1997， 206： 243.

[9] Kitts D D， Weiler K. Bioactive proteins and peptides from food sources： applications of bioprocesses used in isolation and recovery[J]. Curr Pharm Design， 2003， 9（16）： 1309.

[10] Siong H Tan， Rodney J Mailer， Christopher L Blanchard， et al. Extraction and characterization of protein fractions from Australian canola meals[J]. Food Res Inter， 2011， 44： 1075.

[11] Sona Krizkova， Simona Dostalova， Petr Michalek， et al. SDSPAGE as a tool for hydrodynamic diameterdependent separation of quantum dots[J]. Chromatographia， 2015， 78（11）： 785.

[12] 中国药典.四部[S]. 2015.

[13] 卢琳， 段彬伍. 旋光法测定稻米淀粉含量的改进研究[J]. 中国稻米， 2011， 17（1）： 25.

[14] 韦芳三，李纯厚，戴明，等.索氏提取法测定海洋微藻粗脂肪含量及其优化方法的研究[J]. 上海海洋大学学报，2011，20（4）：619.

[15] Ying Shan， Joyce Pepe， Richard W Lambrecht， et al. Mapping of the chick heme oxygenase1 proximal promoter for responsiveness to metalloporphyrins[J]. Arch Biochem Biophys， 2002， 399（2）： 159.

[16] 周虹， 毛建霏， 罗玲， 等. 微波碱水解法测定农产品中色氨酸含量[J]. 食品与发酵科技， 2014， 50（3）： 79.

[17] 李煜，金瓯，郑国钢， 等. 氨基酸分析仪法（过甲酸氧化）测定复方氨基酸注射液（18AA）中胱氨酸的含量[J]. 中国现代应用药学， 2014， 31（7）： 871.

[18] 刘珊珊， 武小霞， 姜振峰， 等. 大豆7S球蛋白β伴大豆球蛋白的研究现状[J]. 大豆科学， 2007， 26（3）： 417.

[19] Sornwatana T， Roytrakul S， Wetprasit N，et al. Brucin， an antibacterial peptide derived from fruit protein of Fructus Bruceae， Brucea javanica （L.） Merr[J]. Lett Appl Microbiol， 2013， 57（2）： 129.

[20] 谢书越， 穆利霞， 廖森泰， 等.抗肿瘤活性肽的研究进展[J]. 食品工业科技， 2015， 36（2）： 368.

[21] 蔺瑞，张美莉，张家超. 裸燕麦球蛋白的分离纯化及其抗氧化活性研究[J]. 食品科学， 2011， 32（1）： 31.

[22] 丁秀臻， 孔祥珍， 陈业明， 等. 大豆球蛋白酶解物的抗氧化性及汞离子结合特性的研究[J]. 食品与发酵工业，2016，42（341）：1.

[23] 侯文娟，张美莉，付媛， 等. 酶法水解荞麦球蛋白制备抗氧化活性肽的研究[J]. 食品科学， 2009， 30（23）： 274.

[责任编辑 丁广治]