紫杉醇生物合成途径及合成生物学研究进展

匡雪君王彩霞邹丽秋　李滢　孙超

[摘要] 紫杉醇是一种从红豆杉植物中提取的具有显著抗癌效果的萜类次生代谢产物。作为有效的抗癌药物，目前生产主要依赖于红豆杉，供求矛盾十分突出。近年来，利用合成生物学技术建立新的紫杉醇来源途径已成为研究热点。目前，紫杉醇合成途径基本框架已经确定；参与紫杉醇合成相关酶基因大部分已被克隆和鉴定；已经在大肠杆菌和酿酒酵母中异源合成了紫杉醇的前体物质紫杉烯和5α羟基紫杉烯。该研究对紫杉醇生物合成途径及紫杉醇药物中间体在大肠杆菌和酿酒酵母工程细胞中的合成进展进行了综述，以期为生物合成紫杉醇进一步研究提供参考。

[关键词] 紫杉醇； 合成途径； 合成生物学

Recent advances in biosynthetic pathway and synthetic biology of taxol

KUANG Xuejun1， WANG Caixia2， ZOU Liqiu1， LI Ying1， SUN Chao1*

（1. Institute of Medicinal Plant Development， China Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，

Beijing 100193， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Taxol， a kind of terpenoid secondary metabolite produced by Taxus brevifolia， is an effective anticancer drug that manufacture relies mainly on the extraction form plants. In order to solve the resource shortage， a lot of work has been done to develop the alternative method. Recently， using synthetic biology to realize heterologous biosynthesis of the precursors of taxol has become a hotspot. Now， the basic framework of taxol biosynthetic pathways has been confirmed， and most enzyme genes involved in taxol biosynthesis have been cloned and identified. The two taxol precursors， taxa4（5），11（12）diene and taxa4（20），11（12）dien5αol， have been synthesized in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Here this paper reviewed the recent advances in the biosynthetic pathway of taxol and the latest developments of synthetic biology， which aims to provide a guidance for the heterologous biosynthesis of taxol.

[Key words] taxol； biosynthetic pathway； synthetic biology

doi：10.4268/cjcmm20162210

紫杉醇是一种复杂的四环二萜类化合物，1971年首次由Wani等从短叶红豆杉Taxus brevifolia Nutt.树皮中提取出来并确定其结构[1]。该植物天然产物具有低毒、高效的抗癌效果，自1992年上市以来，广泛用于卵巢癌、乳腺癌和非小细胞癌的治疗，市场需求巨大[2]。

作为抗癌药物，紫杉醇的分子结构非常复杂，有11个立体中心和1个17碳的四环骨架结构[3]。紫杉醇属于次生代谢产物，合成量少，从短叶红豆杉树皮仅能获得500 mg·kg-1的产量，远远满足不了临床的需要[34]。也有学者对其进行化学合成的研究，但合成路线复杂，而且反应条件难以控制，合成率低。因此，在后续的研究多集中于紫杉醇的半合成法，即首先从紫杉枝叶里提取出紫杉烷类中间产物，如10去乙酰巴卡亭Ⅲ （10deacetylbaccatin Ⅲ，10DAB）和巴卡亭Ⅲ（baccatin Ⅲ）， 然后再经过化学合成得到紫杉醇[56]。该方法获得的紫杉醇纯度高、成本低，是工业化生产紫杉醇的主要方法，合成技术已比较纯熟，但紫杉醇的生产仍受限于其来源植物[6]。红豆杉是国家重点保护野生植物，从其来源植物中大量提取会对红豆杉的生长造成严重威胁，且产量低，不适合大规模生产。利用合成生物学技术，通过微生物来合成紫杉醇的前体巴卡亭Ⅲ，再半合成紫杉醇是目前应用前景最广阔的一种方法，有望解决市场上紫杉醇价格昂贵、供不应求的现状，并且对于濒危药用植物的保护具有十分重要的意义[46]。

1 紫杉醇的生物合成途径

紫杉醇的生物合成可分为3个阶段：①紫杉烷环母核结构的合成，以巴卡亭Ⅲ为产物；②苯基异丝氨酸侧链的合成；③侧链与紫杉烷母核的C13位酰化连接，然后在侧链C2′位和C3′位分别被羟化和苯甲酰化，形成紫杉醇[78]。紫杉醇的生物合成途径见图1。

1.1 紫杉烷环母核结构的合成

1.1.1 三环二萜骨架的形成 作为二萜类化合物，紫杉醇类化合物是通过异戊二烯前体合成的[7]。萜类的异戊二烯结构单元可以通过位于细胞质中的甲羟戊酸途径（mevalonic acid pathway，MVA）或位于质体中的磷酸甲基赤藓糖醇途径（methylerythritol phosphate，MEP）合成[9]。MVA途径起始于乙酰辅酶A，经过6步酶促反应生成异戊烯焦磷酸（IPP）；MEP途径起始于丙酮酸和甘油醛3磷酸，经过7步酶促反应生成IPP[10]。IPP是MVA和MEP途径的共同中间体，在异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI）的作用下，部分IPP可以转化为双键异构体甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP） [11]。对于紫杉醇合成前体的来源还没有定论，用上述 2条途径抑制剂分别处理红豆杉细胞后紫杉醇合成均受到抑制[1213]。IPP和DMAPP缩合，生成二萜化合物的共同前体——牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸 （geranyl geranyl diphosphate，GGPP），然后，GGPP在紫杉烯合成酶（taxadiene synthase，TS）的催化下，环化生成紫杉烯[taxa4（5），11（12）diene]，形成了紫杉醇的三环二萜骨架结构[1415]。

1.1.2 骨架上的官能团反应 紫杉烷环骨架形成后，在 C1，C2，C4，C5，C7，C9，C10和 C13位发生进一步的修饰，最终形成紫杉醇的前体巴卡亭Ⅲ（baccatin Ⅲ）[28]。这些修饰包括羟基化，羟基组上的酰基化、酮基化和环氧丙烷的形成[15] 。通过对天然紫杉烷类化合物含量分析和化学结构推测表明， 羟基化反应与酰基化反应是交互进行的， 即羟基组上的一些酰基化反应可先于新的羟基化反应发生，所以给紫杉醇途径研究增加了难度[29]。Eisenreich 等证实紫杉烷环上的所有羟基化反应均由依赖细胞色素P450的单加氧酶类催化完成[30]。紫杉醇合成过程中，其母核紫杉烯需经 8个碳位的有效羟化，分别是C1位、C2位、C4位、C5位、C7 位、C9位、C10位、C13位[3132]。目前，紫杉醇生物合成过程中的羟化酶研究已取得了一些进展，已经完成了C2 位、C5位、C7 位、C10位、C13位和C14位羟化酶基因的克隆与鉴定，见表1，其中催化C14位羟化的紫杉烷14β羟基化酶（taxol 14βhydroxylase，T14βH）考虑到在紫杉烷的结构中， C14位并没有被氧化， 因此， 推断该酶没参与紫杉醇的生物合成，可能参与紫杉烷类的支路合成途径[18]。在前体巴卡亭Ⅲ合成过程中，关于依赖乙酰辅酶A的酰化反应，目前已经完成3个基因的克隆与鉴定，分别为：紫杉烯醇5α乙酰氧化基转移酶（taxadienol 5αOacetyl transferase，TAT）、紫杉烷2α苯甲酰基转移酶（taxane2αObenzoyltransferase，TBT）和10β去乙酰巴卡亭Ⅲ乙酰氧基转移酶（10deacetylbaccatin Ⅲ10Oacetyltransferase，DBAT）[2224]。

除了紫杉烯的 C5 位最先羟化外，其他位点的羟化顺序及参与酶的底物特异性仍不明确[3334]。紫杉烯由紫杉烯 5α羟基化酶 （taxadiene 5αhydroxylase，T5αH） 在 C5 位上引入羟基，生成5α羟基紫杉烯[taxa4（20），11（12）dien5αol][19]。接着从5α羟基紫杉烯到2debenzoyltaxan的反应有2种推测[3536]：一是此萜烯中间体在 5α 羟基上由TAT酶催化其发生乙酰化反应形成taxa4（20），11（12）diene5αyl acetate，再经紫杉烷 10β羟基化酶（taxoid 10βhydroxylase，T10βH）在 10 位上发生羟化反应，然后如何生成2debenzoyltaxan不清楚[35]；二是此萜烯中间体在紫杉烷 13α羟基化酶（taxoid 13αhydroxylase，T13αH）催化作用下C13 位发生羟化反应，生成taxa4（20），11（12）diene5a，13diol，然而对于其他位点C1，C2，C4，C7，C9 位发生的羟基化作用，4，5环氧丙烷环的形成，C2，C5，C10 位羟基上的酰基化和 C9 位的酮基化反应发生的顺序尚不明确[3637]，见图1。2debenzoyltaxan形成后，由TBT催化其生成10去乙酰巴卡亭Ⅲ（10deacetyl baccatin Ⅲ，10DAB），然后发生紫杉烷环母核上的最后一步修饰反应——DBAT催化10去乙酰巴卡亭Ⅲ生成巴卡亭Ⅲ[2324]。

1.2 苯基异丝氨酸侧链的合成

C13位侧链是保证紫杉醇抗癌活性的关键因素，而且代谢调控研究表明侧链对终产物合成限速影响大于三环二萜骨架[38]， 因此了解侧链生物合成途径， 对提高紫杉醇的生物合成量具有实际意义。C13 苯基异丝氨酸侧链起源、侧链的连结次序和方式、组装至巴卡亭Ⅲ形成紫杉醇的路径都已清楚，绝大部分相关酶基因也已被克隆，见表1。侧链的合成由两步反应完成：首先，α苯丙氨酸（αphenylalanine）在苯丙氨酸氨基变位酶（phenylalanine aminomutase，PAM）的作用下异构化为β苯丙氨酸（βphenylalanine）[27]，再与乙酰辅酶A结合生成βphenylalanyl CoA，目前此连接酶基因尚未克隆获得[39]。

1.3 紫杉醇的形成

首先，巴卡亭Ⅲ 3氨基3苯丙醇基转移酶（baccatin Ⅲ：3amino3phenylpropanoyltransferase，BAPT）以βphenylalanyl CoA作为酰基供体，催化巴卡亭Ⅲ的C13 位酰化形成βphenylalanyl baccatin Ⅲ[25]，再经过侧链的羟化作用形成3′N去苯甲酰紫杉醇（3′Ndebenzoyltaxol），这一步的细胞色素P450羟化酶尚未克隆获得[40]。然后3′N去苯甲酰2′脱氧紫杉醇 N苯甲酰基转移酶（3′Ndebenzoyl2′deoxytaxol Nbenzoyltransferase，DBTNPT）催化侧链上 C3′位N原子发生苯甲酰化生成终产物紫杉醇[26]。

2 紫杉醇的合成生物学研究

随着紫杉醇代谢途径的逐步阐明，紫杉醇生物合成途经的一些步骤已经被转化到大肠杆菌，酿酒酵母这些异源表达系统，制备获得了不同的紫杉醇中间体，如紫杉烯和5α羟基紫杉烯[4149]。

2.1 大肠杆菌作为工程菌合成紫杉醇前体

紫杉烯是紫杉醇合成途径中的一个重要中间产物，许多学者在大肠杆菌中对其进行了合成生物学研究[4244]。2001年，Hang等[42]将DXP合酶基因、IPP异构酶基因、GGPP合酶基因以及紫杉烯合酶基因在大肠杆菌中共表达，以异戊二烯焦磷酸为原料进行发酵，首次通过工程菌株获得了紫杉醇合成途径中的重要中间体紫杉烯，产量达到1.3 mg·L-1。紫杉烯在工程菌株中的成功合成说明了在微生物中通过组合不同的紫杉醇生物合成相关基因来获得目标产物的方法是可行的。Ajikumar 等[43]在大肠杆菌中使用多元模块代谢工程（multiple module metabolic engineering，MMME），以IPP为节点，将紫杉醇生物合成途径分为2个模块，即：产IPP的内源性MEP途径的上游模块和合成异源萜类化合物途径的下游模块。上游模块包括MEP途径的4个关键酶基因，即：dxs， idi， ispD， ispF，下游模块包括紫杉醇代谢途径中的2个基因：GGPP 合酶基因和紫杉二烯合成酶基因。首先，将下游模块导入底盘细胞中，上游代谢模块的4个基因由操纵子（dxsidiispDF）控制过表达，然后，利用改变质粒拷贝数和启动子强度的方法调节下游模块2个基因的表达强度。通过上下游模块的平衡使整个代谢途径达到最优化，使大肠杆菌中紫杉烯达到几乎1 g·L-1的产量，这在目前是紫杉烯最高的产量。他们也进行了紫杉烯下一步的转化，利用T5αH 使5α羟基紫杉烯的产量达到58 mg·L-1。近来，Biggs等[44]通过优化细胞色素P450酶在大肠杆菌中的表达，使总的氧化紫杉烷类产量达到570 mg·L-1。

2.2 酵母菌作为工程菌合成紫杉醇前体

由于大肠杆菌是原核生物，不含Ⅱ型P450氧化酶及还原酶的偶联并缺少完整的内膜系统，细胞色素P450酶不能定位表达，而酵母菌可以产生有功能的Ⅱ型P450单加氧酶，并且具有完整的细胞内膜系统，能确保与紫杉醇生物合成相关的羟化酶基因的共表达，因此，酿酒酵母细胞更适合于较为复杂产物的合成[4546]。P450介导的氧化反应是紫衫烯合成巴卡亭Ⅲ的必经反应，故酵母菌成为表达紫杉醇中间产物的另一个选择。2006年，DeJong等[47]将紫杉醇合成途经中从IPP到taxa4（20），11（12）diene5aacetoxy10βol的5个基因导入酿酒酵母，它们分别为：GGPPS基因，TS基因，T5αH基因，TAT基因和T10βH基因。然而，只有紫杉二烯的产量达到mg·L-1的级别，5α羟基紫杉烯的产量仅有25 mg·L-1，5α羟基紫杉烯接下来两步反应的产物taxa4（20），11（12）diene5ayl acetate和taxa4（20），11（12）diene5aacetoxy10βol均没有检测到。该研究表明细胞色素P450酶T5αH介导的第一步氢化反应是限速步骤。Rontein等[48]在酵母菌中构建了紫杉烯5α羟基化酶、细胞色素P450还原酶融合基因，获得的工程菌能够进行第一步氧化反应。2008年，Engels 等[49]将密码子优化的荆江红豆杉的TS基因、HMGCoA还原酶基因、UPC21转录因子基因和噬酸热硫化叶菌的GGPP合成酶基因导入酿酒酵母来生产紫杉醇的中间产物紫杉二烯。UPC21是酵母中调节甾醇生物合成的一个通用转录因子，通过加入UPC21，可以促进酵母细胞在有氧生长条件下吸收利用甾醇，降低甾醇的生物合成与构建的紫杉烯合成途径的竞争。采用噬酸热硫化叶菌的GGPP合成酶基因也是为了避免和甾体化合物合成竞争。最后，工程菌中紫杉二烯的产量达到8.7 mg·L-1，同时还有未被TS催化合成紫杉烯的前体物质牻牛儿基牻牛儿醇（geranylgeraniol） 33.1 mg·L-1，说明了紫杉烯的产量能得到进一步的提高。

3 展望

紫杉醇作为治疗乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌的一线药物，目前的生产主要依赖于从红豆杉中提取前体之后再化学合成。开发成本低且产率高的生物合成的方法尤为重要，对紫杉醇生物合成路径及相关酶的研究是进行紫杉醇异源生物合成的基础。目前，紫杉醇合成途径基本框架已经确定，参与的大部分酶也已经克隆得到，已经可以在大肠杆菌和酿酒酵母中异源合成紫杉醇的前体物质紫杉烯和5α羟基紫杉烯，但是由于紫杉醇生物合成途径仍然没有完全清楚，导致对紫衫烯到紫杉醇阶段的合成研究较少，因此要利用生物合成实现紫杉醇的持续供应仍需付出艰苦努力。本草基因组学（herbgenomics）的快速发展为合成生物学研究提供了大量可供选择和改造的生物学元器件，综合运用各种组学技术，将极大地加速天然产物合成途径的解析研究[5051]。

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[责任编辑 孔晶晶]