MGIT960分枝杆菌液体快速培养前处理方式的临床评价

吕纯芳 张涛 卢留珠 郑文斌



MGIT960分枝杆菌液体快速培养前处理方式的临床评价

吕纯芳 张涛 卢留珠 郑文斌

目的 探讨原装进口配套试剂、传统常用的4%氢氧化钠前处理液与手工配制的NaOH-NALC前处理液对分枝杆菌液体快速培养指标的影响，建立一种适合国内现状的分枝杆菌液体快速培养前处理方法。方法 通过原装进口样本前处理液、4%氢氧化钠样本前处理液、手工配制的NAOH-NALC对五类抗酸染色级别不同的痰标本进行培养前平行处理，观察不同前处理方法分枝杆菌培养阳性率、平均报阳天数及污染率并进行试剂成本核算。结果 三种前处理方法阳性率一致。原装进口试剂组和NAOH-NALC手工配制组平均报阳时间为8天，两组没有明显区别，而4%氢氧化钠样本处理组较另两组平均报阳天数要长，统计学差异显著(P<0.01)。三种处理方式的污染率差别不具有统计学意义。平均每例耗材花费情况原装进口试剂组86.00元、4%氢氧化钠样本处理组73.50元、NAOH-NALC手工配制组77.30元。结论 NAOH-NALC手工配制组相较4%氢氧化钠组明显缩短了分枝杆菌快速培养的报阳天数，污染率无差别，而相比原装进口试剂组耗材花费经济便宜。因此NAOH-NALC手工配制前处理方式适合成为MGIT960分枝杆菌液体快速培养前处理首选方式。

分枝杆菌；快速培养；前处理；MGIT960系统

结核分枝杆菌的培养技术一直以来都作为结核病诊断的“金标准”。2007年，WHO推荐在全球范围包括中等及低收入国家广泛采用结核分枝杆菌液体快速培养技术[1]，这使商品化MGIT 960系统取代传统固体培养方法进行大规模临床应用成为了现实可能。目前国内在MGIT 960商品化结核分枝杆菌液体快培技术方面的临床使用技巧与国外相比还有一定差距，例如同样使用MGIT 960液体快培技术，国内的平均报阳时间平均12天左右[2-3],而国外使用者的平均报阳时间多在7-10天[4-5]，可能与国内临床样本的前处理技术的不完善有着较大关系。随着MGIT 960商品化结核分枝杆菌液体快培技术在国内的广泛推开，样本前处理技术方面的探讨也将成为必然。

我们本次研究采用厂家原装进口配套样本前处理液、国内临床常用的4%氢氧化钠样本前处理液、手工配制的NaOH-NALC样本前处理液对临床痰标本进行培养前平行处理，观察不同前处理方式对分枝杆菌培养的阳性率、报阳天数及污染率的影响，并进行试剂成本核算，寻找一种目前最适合国内现状的分枝杆菌液体快速培养的样本前处理方式并建立标准化的临床操作程序以期为结核病的防治提供实验室技术支持。

资料与方法

一、仪器和试剂

BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌快速培养系统及其配套的培养管、营养添加剂、抑菌剂由BD公司生产。氢氧化钠(NaOH)、N-乙酰半胱氨酸(NALC)由Sigma公司提供。二水合柠檬酸三钠、磷酸盐由广东光华公司提供。

二、标本来源

痰液标本采自2015年1月至12月深圳市南山区慢性病防治院门诊患者，涂片抗酸染色未发现抗酸杆菌标本40例，涂片抗酸染色阳性1+、2+、3+、4+标本各40例，共200例。

三、前处理方式

原装进口配套试剂组：添加与样本等量的 原装商品NaOH-NALC-柠檬酸盐溶液，振荡，消化15min，添加磷酸盐缓冲液至50mL,低温离心3000g、 20min，倾去上清液，再加入少量1-2mL磷酸盐缓冲液，重悬沉淀物，进行MGIT培养管接种。4%氢氧化钠样本处理组：制备4% NaOH溶液，根据标本的粘稠程度，加1-2倍体积的4%NaOH，振荡，消化15min，添加磷酸盐缓冲液至50mL,低温离心3000g、20min，倾去上清液，再加入少量磷酸盐缓冲液，重悬沉淀物，进行MGIT培养管接种。NAOH-NALC手工配制组：制备2.9%的柠檬酸钠溶液，高压灭菌。使用之前先将等量的4%NaOH溶液与柠檬酸钠溶液混合，添加NALC粉末，实现终浓度2% NaOH+0.5% NALC溶液，混合均匀并在同一天使用，超过24小时之后，NALC就会丧失活性。在标本中加入标本等量的混合溶液，振荡，消化15min，添加磷酸盐缓冲液至50mL,低温离心3000g、 20min，倾去上清液，再加入少量1-2mL磷酸盐缓冲液，重悬沉淀物，进行MGIT培养管接种。

四、统计学处理

数据的整理分析使用SAS9.1软件。实验数据的计量资料偏态分布采用中位数和四分位数间距表示，率的比较采用χ2检验进行，如果不满足χ2检验条件，则采用确切概率法进行率的比较，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、抗酸染色级别不同的痰标本MGIT960液体结核分枝杆菌分离培养阳性率和平均报阳时间

本实验采用随机区组设计将痰涂片阳性级别一致的痰涂片分为一组，每组40例(5组，共200例)，来消除痰涂片阳性级别对报阳时间的影响，每一份痰样本分别采用原装进口配套试剂、传统常用的4%氢氧化钠前处理液与手工配制的NaOH-NALC前处理液平行前处理后培养，比较三组的阳性率、平均报阳时间。实验结果显示三组阳性率一致(见表1)。

表1 不同的痰标本MGIT960液体结核分枝杆菌分离培养阳性率(阳新例数/总例数)

平均报阳时间采用随机区组设计的秩和检验进行分析，结果显示P<0.0001，表明三组平均报阳时间是不同的，差异具有统计学意义。进一步进行两两比较显示原装进口试剂组和NAOH-NALC手工配制组平均报阳时间为8天，两组没有明显区别，而4%氢氧化钠样本处理组较另两组平均报阳天数要长，统计学差异显著，P<0.01。(见表2)。

二、痰涂片抗酸染色级别不同MGIT960液体结核分枝杆菌分离培养污染情况

采用χ2检验进行率的比较，结果显示P值均大于0.05，表明三种培养方式的污染情况差别不具有统计学意义。(见表3)。

三、三种前处理方法耗材花费

本次试验研究还对三种前处理方式MGIT960液体结核分枝杆菌分离培养所需试剂耗材进行了试剂成本核算，为试验方法提供试剂花费评估。NAOH-NALC手工配制组相比原装进口试剂组耗材花费经济便宜。(见表4)。

讨 论

结核病全球疫情依然十分严重,据据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家的成人中结核分枝杆菌携带率高达80%。作为感染性疾病的头号杀手，全球每年都有数以百万计的人口死于结核病。结核分枝杆菌传统检测方法主要是涂片抗酸染色和改良罗氏培养。随着结核分枝杆菌液体快速培养技术MGIT 960在国内外临床的广泛应用[6-8]，其技术优越性得到了充分发挥，阳性率显著高于传统罗氏培养法，培养报阳时间大幅缩短，从4周左右缩短到10-12天，为早期发现结核病人及对病人疗效的评价起到了极大的促进作用。

表2 抗酸染色级别不同的痰标本MGIT960液体结核分枝杆菌分离培养平均报阳时间

注：因数据不符合正态分布，采用中位数+四分位数间距表示。

表3 抗酸染色级别不同MGIT960液体结核分枝杆菌分离培养污染情况

表4 三种前处理方法耗材花费(人民币元/每人次)

由于大多数临床痰样本多含有大量杂菌，如果前处理去污染环节做不好，杂菌很有可能抑制分枝杆菌的生长甚至造成试验的污染。但过度的去杂菌防污染前处理环节也会抑制分枝杆菌的生长造成结核分枝杆菌培养的失败[9]。因此分枝杆菌液体快培样本前处理技术已成为商品化结核分枝杆菌快速培养成功与否的重要环节。国外近年来这方面的临床研究较多，有人寄希望采用不同于传统方法的新材料[10]，但更多的临床试验还是集中于传统方法的改良及微调[11-12]。

本研究通过采用国外厂家原装进口配套样本前处理液、国内临床常用的4%氢氧化钠样本前处理液、手工配制的NaOH-NALC样本前处理液对五类抗酸染色级别不同的痰标本进行培养前平行处理，结果显示三种前处理方法阳性率一致。原装进口试剂组和NAOH-NALC手工配制组平均报阳时间为8天，两组没有明显区别，而4%氢氧化钠样本处理组较另两组平均报阳天数要长，统计学差异显著(P<0.01)。三种处理方式的污染率差别不具有统计学意义。平均每例耗材花费情况原装进口试剂组86.00元、4%氢氧化钠样本处理组73.50元、NAOH-NALC配制组77.30元。

综上所述本研究表明NAOH-NALC手工配制组明显缩短了分枝杆菌快速培养的报阳天数，污染率无差别，而相比原装进口试剂组耗材花费经济便宜。因此NAOH-NALC手工配制前处理方式适合成为MGIT960分枝杆菌液体快速培养前处理首选方式。

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Clinical evaluation of the pretreatment method for rapid culture of Mycobacterium tuberculosis MGIT960 system

LYUChun-fang,ZHANGTao,LULiu-zhu,ZHENWen-Bin

ShenzhenNanshanCenterforChronicDiseaseControl,Shenzhen,Guangdong518054,China

Objective To establish a pretreatment method for mycobacterium tuberculosis rapid culture in the domestic situation and to discuss the effect on indicators of the rapid culture for mycobacterium tuberculosis comparing the pretreatment methods which include original imported kit, traditional 4% sodium hydroxide pretreatment solution and handcrafted NaOH-NALC pretreatment liquid. Methods Parallel pretreatment culture of the five level of acid fast staining sputum were through original imported kit, traditional 4% sodium hydroxide pretreatment solution and handcrafted NaOH-NALC pretreatment liquid. The positive reporting days, positive rate, contamination rate and reagent cost were analyzed. Results The positive rate of the three methods were consistent. There was no significant difference between the original import reagent group and the NAOH-NALC preparation group. The average positive report time was 8 days. The average positive report days of the 4% sodium hydroxide group was longer, which was statistically significant difference with the other two groups (P<0.01). The pollution rate of the three treatments was not statistically significant. The average cost of each case was 86.00 Yuan in the original import reagent group, 73.50 Yuan in the 4% sodium hydroxide group, and 77.30 Yuan in the handcrafted NaOH-NALC group. Conclusion Compared with the 4% sodium hydroxide group, the positive report days of rapid culture of mycobacterium in the handcrafted NaOH-NALC group is significantly reduced and the pollution rate has no difference, but the average cost in the handcrafted NaOH-NALC group is cheaper than the original import reagents group. Therefore, the handcrafted NaOH-NALC pretreatment method is suitable to become the preferred pretreatment method of MGIT960 Mycobacterium liquid rapid culture.

mycobacteria; rapid culture; pretreatment; MGIT960 system

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.03.038

深圳市南山区科技创新局资助(No 2014018)

518054 广东 深圳，深圳市南山区慢性病防治院

2016-05-06]