ADAM17-shRNA在缺氧条件下对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响*

陈国福，吴丽君，张雪鹏，蔡 准，孟祥潮

(华北理工大学附属医院肿瘤外科，唐山 063000)

ADAM17-shRNA在缺氧条件下对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响*

陈国福，吴丽君，张雪鹏△，蔡 准，孟祥潮

(华北理工大学附属医院肿瘤外科，唐山 063000)

目的 研究在缺氧环境下靶向针对解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)的短发夹状RNA(shRNA)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。方法 针对ADAM17设计4个特异性的ADAM17-shRNA，经电穿孔法转染MCF-7细胞。缺氧条件下培养细胞。试验分为：对照组(空白磷酸盐缓冲液)、无义序列组(转染无义序列ADAM17-shRNA)和shRNA转染组(转染ADAM17-shRNA，选择沉默ADAM17基因效率最高的shRNA用于后续试验)。分别采用实时荧光定量PCR、iCELLigence、流式细胞仪检测细胞ADAM17mRNA的表达水平、细胞增殖活性和细胞周期变化。结果 4个shRNA转染组对MCF-7细胞的ADAM17基因表达均有沉默作用，与对照组及无义序列组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)，尤以shRNA1219抑制率最高(F=5.11,P<0.01)。shRNA转染组的细胞生长速度和增殖活性较对照组和无义序列组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。shRNA转染组的绝大多数细胞停留在G0/G1期(73.35±2.45)，与对照组(62.56±2.35)、无义序列组(62.68±1.20)相比较,差异有统计学意义(P<0.05)，细胞周期进展明显延缓。结论ADAM17-shRNA在缺氧条件下抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖。

RNA；聚合酶链反应；缺氧；解聚素-金属蛋白酶17；RNA干扰；增殖

当今乳腺癌发病率呈逐年上升趋势，成为威胁女性健康的重要恶性肿瘤。对乳腺癌的病因学及发病机制的研究成为热点。解聚素-金属蛋白酶17(ADAM17)是解聚素-金属蛋白酶家族的重要成员之一。具有解聚素和金属蛋白酶的活性。近年来ADAM17在乳腺癌中的作用也越来越被关注。课题组前期研究提示ADAM17在乳腺癌的发生、发展的整个进程中起到了极其重要的作用[1]。然而肿瘤组织在快速增长过程中，必然会造成局部组织缺氧，缺氧对肿瘤的生长、增殖、凋亡、转移和侵袭等发挥重要且复杂的作用。研究已证实缺氧是乳腺癌等实体肿瘤物理微环境的基本特征之一[2]。本研究通过在缺氧条件下利用RNA干扰技术靶向针对ADAM17基因的短发夹RNA对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响，从而揭示缺氧条件下ADAM17与肿瘤细胞增殖的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7细胞由华北理工大学医学实验中心提供；Trizol、M-MLV逆转录试剂盒、PIatimum SYBR PCR试剂盒均由Invitrogen公司提供；ADAM17-shRNA和ADAM17-shNC载体购于上海吉玛制药技术有限公司，每个载体均包含绿色荧光蛋白GFP的表达框架，根据绿色荧光蛋白的表达情况来确定转染效率。靶序列见表1。

表1 ADAM17的不同靶序列

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人乳腺癌MCF-7细胞用含有10%胎牛血清，1%青链霉素的DMEM高糖培养基，置于37 ℃恒温，冲入含1%O2、5%CO2、94%N2的混合气体赛默Thermo3131三气水套式培养箱下行缺氧环境培养。

1.2.2 电穿孔法转染 收集细胞，吸取20 μL Opti-MEM Ⅰ悬浮细胞1×106，每个电击杯中添加5 μL的ADAM17-shRNA表达载体，加入质粒。充分混匀细胞，上机操作。设置CUY21 EDIT Ⅱ细胞电转化仪的输出电压(125 V)、脉冲宽度(10 ms)和电转时间(1 min)，电处理结束后，加入完全培养液。试验分为对照组、shRNA转染组和无义序列组，同样采用电穿孔法转染对照组和无义序列组，对照组加入与转染试剂和ADAM17-shRNA载体混合总量等量的磷酸盐缓冲液(PBS)；无义序列组加入等量的转染试剂和无义序列ADAM17-shNC载体。

1.2.3 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测细胞的ADAM17基因表达 转染成功后12～24 h，缺氧条件下培养24～48 h后，收集各组细胞，经Trizol试剂说明书一步法提取总RNA，测定总RNA的纯度和浓度符合试验要求后采用M-MLV逆转录试剂盒合成cDNA，PIatimum SYBR试剂盒进行PCR扩增反应，根据ADAM17引物序列：上游5′-ATC AAA CCC TTT CCT GCG-3′，下游5′-CAA ACC CAT CCT CGT CCA-3′，扩增片段154 bp；β-actin内参引物序列：上游5′-GTC ACC TTC ACC GTT CCA GTT TT-3′，下游5′-TTC TTT CCC ACA TTG CGT TGA TTC-3′，扩增片段175 bp；并通过检测转染ADAM17 mRNA的表达情况，筛选出抑制ADAM17 mRNA 最高的shRNA，用于后续试验。对 Real-time PCR的结果采用相对定量的方法进行数据分析。

1.2.4 iCELLigence检测细胞的增殖曲线 细胞成功转染后，使用iCELLigence系统进行检测，取出E-Plate L8，在孔中加入300 μL混合均匀的3组细胞悬液，放到三气水套式培养箱中的iCELLigence上行缺氧培养。采用iCELLigence系统检测MCF-7细胞的生长和增殖过程，系统传感器检测获得的细胞阻抗参数-细胞指数(CI)，应用iCelligence DA Software 2.0软件进行试验数据分析和图像处理。

1.2.5 流式细胞技术仪分析细胞周期 转染后，缺氧条件下培养24 h后，收集各组细胞悬液，加入预冷的70%乙醇2 mL充分悬浮细胞，置于4 ℃固定细胞24 h以上。细胞固定好后，加入浓度为50 μg/mL的碘化丙啶(PI)500 μL，常温下避光染色30 min。用钼滤网过滤细胞悬液，采用标准程序经流式细胞仪检测结果。

2 结 果

2.1shRNA载体转染乳腺癌MCF-7细胞的效率评价shRNA表达载体转染后，连续培养48h后置于荧光倒置相差显微镜下观察细胞转染效率，结果表明电穿孔转染法的效率高达95%以上，见图1。

A：转染shRNA荧光图像；B：转染shRNA明场图像；C：A和B的叠加图像。

图1 荧光倒置相差显微镜下观察电穿孔法转染效率(×100)

2.2ADAM17mRNA表达的水平 无义序列组(2-△△CT=0.97±0.14)与对照组比较，ADAM17mRNA的表达无明显变化，两者差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组及无义序列组相比，shRNA转染组的4个序列中ADAM17mRNA表达水平均(转染shRNA-297，2-△△CT=0.76±0.08；转染shRNA-1134，2-△△CT=0.59±0.15；转染shRNA-1219，2-△△CT=0.52±0.09；转染shRNA-1508，2-△△CT=0.52±0.21)明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，尤以shRNA1219抑制率最高(F=5.11,P<0.01)，用于后续试验。在缺氧条件下特异性的ADAM17-shRNA表达载体可显著地抑制ADAM17mRNA的表达。

2.3 细胞生长曲线和增殖活性 经iCelligenceDASoftware1.0软件处理分析后得到细胞生长曲线，并测得对照组、无义序列组和shRNA转染组的CI分别为2.86、2.73和1.27。无义序列组和对照组的MCF-7细胞的生长速度和增殖活性无明显变化(P>0.05)；但与对照组与无义序列组相比较，shRNA转染组的MCF-7细胞的生长速度减慢，增殖活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.4 细胞周期的变化 流式细胞仪检测shRNA转染组处于G0/G1期的细胞比例显著高于无义序列组和对照组，处于S期和G2/M期的细胞比例均显著低于无义序列组和对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；对照组和无义序列组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图3、表2。

图2 各组细胞的生长曲线

A：对照组；B：无义序列组；C：shRNA转染组。

图3 各组细胞的流式细胞周期图表2 各组细胞周期的各期的情况

a：P<0.05，与shRNA转染组比较。

3 讨 论

ADAM17是解聚素-金属蛋白酶家族的重要成员之一，具有解聚素和金属蛋白酶的活性，ADAM17发挥蛋白剪切酶样的作用，从而调节细胞的增殖、迁移运动等多种生物学行为[3-4]。目前研究发现ADAM17在乳腺癌的发生和发展的过程中扮演着很重要的角色。Giricz等[5]研究发现ADAM17可以通过EGFR-PI3K-AKT信号通路途径，促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。Sternlicht等[6]报道ADAM17可通过激活双调蛋白来促进乳腺癌的发生和发展。原庆会等[7]发现乳腺癌组织中ADAM17mRNA和蛋白水平与临床病理分期密切相关，ADAM17蛋白水平与TNM分期呈正相关。Narita等[8]研究发现ADAM17在乳腺癌组织中呈现高表达，并且随组织的恶性程度、临床分期的增加和淋巴结转移而表达增高。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)表现为双链RNA以序列特异性的方式来沉默内源性基因的表达。目前大多数siRNA表达载体被设计成能表达短发夹状RNA(shRNA)，从而使得shRNA在细胞内表达，随后在体内加工生成siRNA，进一步发挥基因沉默的作用。本研究首先针对ADAM17设计合成具有特异性的ADAM17-shRNA，经电转染法转染乳腺癌MCF-7细胞，发现转染效率高达90%以上。试验结果说明shRNA的4个转染组中ADAM17mRNA的表达水平均明显降低(P<0.05)；shRNA转染组的MCF-7细胞生长速度和增殖活性显著降低(P<0.05)；shRNA转染组的细胞周期进展延缓。彭晓兵等[9]研究发现ADAM17-shRNA转染的SD大鼠BMSC对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力有显著的抑制作用。丁华等[10]发现转染ADAM17-shRNA的大鼠骨髓间充质干细胞对MCF-7细胞ADAM17mRNA的表达有显著抑制作用，对细胞的体外侵袭能力也有明显抑制作用。说明靶向针对ADAM17基因的shRNA可以有效抑制MCF-7细胞ADAM17mRNA的表达，进而抑制细胞的增殖，延缓细胞周期的进展。

同时，肿瘤细胞的生长还需考虑肿瘤内部的缺氧微环境对肿瘤形成、进展和转移等的影响作用。恶性肿瘤快速增长，从而使它对氧的需求量增加；另外，一部分肿瘤组织逐渐远离具有丰富营养来源的血管而出现肿瘤血供不足，导致这一部分肿瘤组织缺氧坏死。赵婷婷等[11]发现缺氧降低乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力，增加其侵袭、转移能力，但并没有阐明其作用机制。杨雪飞等[12]研究发现缺氧可以导致人非小细胞肺癌A549系凋亡,但能增加存活细胞的侵袭能力。

目前模拟细胞缺氧环境主要有两种方式：化学缺氧法和物理缺氧法。本试验采用物理缺氧法，充入含1%的O2、5%的CO2、94%的N2的赛默Thermo3131三气水套式培养箱来模拟肿瘤细胞的体外缺氧微环境，更近似体内肿瘤缺氧微环境来研究缺氧对肿瘤细胞增殖的影响。本试验在缺氧条件下研究靶向针对ADAM17基因的shRNA对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。结果同样说明ADAM17-shRNA在缺氧条件下对MCF-7细胞的ADAM17基因具有沉默作用，从而导致细胞的生长速度和增殖活性降低，细胞周期进展延缓，抑制了细胞增殖。同样与本研究结果相似，张博等[13]发现缺氧条件下通过上调miRNA-21多个信号通路靶基因，诱导乳腺癌细胞凋亡率增加。王晗等[14]研究发现RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α能够促进MCF-7凋亡,下调VEGF表达,推迟细胞周期。ADAM17在乳腺癌的形成和发展的过程中起到重要的作用，因此以ADAM17作为治疗乳腺癌药物研究的一个靶点，在缺氧环境下利用RNA干扰技术的优势进行抗肿瘤药物的研究，是对现有乳腺癌基因靶向治疗起到重要的补充和完善作用。因此，该试验研究将能够进一步地为乳腺癌的靶向治疗领域提供新的研究方向。

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Effect of ADAM17-shRNA on proliferation of human breast cancer cell line MCF-7 in hypoxia*

ChenGuofu,WuLijun,ZhangXuepeng△,CaiZhun,MengXiangchao

(DepartmentofSurgicalOncology,AffiliatedHospital,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To investigate the effects of shRNA targeting a disintegrin and metalloproteinases 17( ADAM17) on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells in hypoxia environment.Methods The four specific ADAM17-shRNA sequences aiming at ADAM17 were designed,transfected into MCF-7 cells by electroporation,and cultured in hypoxia environment.The experiment was divided into the control group (blank phosphate buffer solution,PBS),nonsense sequence group (transfected with ADAM17-shNC) and shRNA transfection group (transfected with ADAM17-shRNA,the highest silencing efficiency of shRNA was selected for following experiments).Real-time PCR was used to detect the expression of ADAM17 mRNA.The proliferation ability and cell cycle change of MCF-7 cells were detected by iCELLigence and flow cytometry (FCM),respectively.Results Compared with control group and nonsense sequence group,the four ADAM17-shRNA transfection groups all had the silence effect on ADAM17 gene expression (P<0.05),the difference was statistically significant(P<0.05),particularly shRNA1219 had the highest inhibitory rate (F=5.11,P<0.01).The cellular proliferation ability and cell growth speed in the shRNA transfection group were significantly decreased compared with the control group and nonsense sequence group (P<0.05).Most cells of shRNA transfection group remained in the G0/G1phase (73.35±2.45),which in the control group and nonsense sequence group was (62.56±2.35) and (62.68±1.20) respectively,the difference was statistically significant(P<0.05).The cell cycle progression was significantly delayed.Conclusion ADAM17-shRNA inhibits the proliferation of MCF-7 cells under hypoxic environment.

RNA；polymerase chain reaction ；hypoxia;depolymerization metalloproteinases 17;RNAi;proliferation

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.01.004

河北省自然科学基金资助项目(C2010001767)；唐山市科学技术研究与发展计划项目(14130256B)。

陈国福(1989-),在读硕士，主要从事乳腺癌的基础与临床方面研究。△

E-mail:syzxp@sina.com。

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A

1671-8348(2017)01-0029-04

2016-07-18

2016-09-08)