4 ℃冷藏对厌氧发酵接种物活性的影响

陈柳萌,勒系意,聂 红,桂 伦,熊江花,俞 莹,张 诚*

(1.江西省农业科学院 农业应用微生物研究所,江西 南昌 330200;2.江西师范大学 生命科学学院,江西 南昌 330022;3.江西省农业环境监测站,江西 南昌 330200)

4 ℃冷藏对厌氧发酵接种物活性的影响

陈柳萌1,勒系意2,聂 红1,桂 伦1,熊江花3,俞 莹3,张 诚1*

(1.江西省农业科学院 农业应用微生物研究所,江西 南昌 330200;2.江西师范大学 生命科学学院,江西 南昌 330022;3.江西省农业环境监测站,江西 南昌 330200)

设计3个冷藏组(7、14、21 d)和2个对照组(未处理、常温21 d),通过厌氧发酵接种物的理化指标(pH值、VFA、TIC、NH4+-N)测定、菌落结构分析和厌氧发酵产甲烷能力测试,研究了4 ℃冷藏处理对厌氧发酵接种物活性的影响。结果表明:接种物在4 ℃冷藏过程中,代表产甲烷菌的优势条带随冷藏时间的延长出现了亮度下降，并有少量条带丢失的现象;其厌氧发酵产甲烷能力出现下降,前15 d的日产甲烷速率明显低于未处理组的;但冷藏处理能够减缓氨氮浓度的增高,有助于接种物的厌氧发酵活性的恢复。

冷藏；接种物；厌氧发酵；活性

厌氧发酵技术作为环境生物技术的核心之一[1],是通过微生物的活动来处理各类有机废弃物(农业秸秆、城市垃圾、畜禽粪便与市政污泥),以实现改善环境质量的目的,与此同时还可生产优质、清洁的生物质能源用以替代传统化石能源,这对于能源与环境的和谐发展有着极为重要的促进作用。

厌氧发酵接种物随着厌氧发酵技术的广泛应用而越来越受重视。相关研究表明,在厌氧发生器中投入接种物对厌氧发酵有明显的促进作用[2-4]。大多沼气工程也在实践中通过接种厌氧发酵接种物来缩短反应器的启动时间。但接种物中厌氧菌群因其体积小、易流失、对环境条件敏感等特点,在保藏、运输环节中容易受损。因此,笔者从接种物的理化指标、菌落结构和厌氧产甲烷能力三个方面开展实验,考察了4 ℃冷藏条件(基于微生物保藏需求与现代物流配送体系考虑)对厌氧发酵接种物活性的影响,以期为接种物的保藏运输和工程应用提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

厌氧污泥:收集自江西省新余市罗坊沼气站1号发酵罐,采用氮气隔氧保存。发酵原料:选用金针菇菌包,收集自江西省农业科学院农业应用微生物研究所金针菇示范基地；将其阴干粉碎,4 ℃冷藏备用。

1.2 仪器设备

全自动产甲烷潜力分析测试系统(AMPTS II),由瑞典Bioprocess Control AB公司研发。该系统分为UNIT A(发酵单元)、UNIT B(酸性气体吸附单元)、UNIT C(甲烷气体计量单元)三个部分。A单元共有15个发酵瓶,每个发酵瓶配有可调转速及搅拌频率的机械搅拌系统;B单元共有15个吸收瓶,配有3 mol/L NaOH溶液以吸附沼气中的酸性气体；C单元内置模型和算法，结合温度、压力传感器，弱化了水蒸气和发酵瓶中高估气体的量对实际产甲烷量的影响,最终记录的甲烷气体数值为转换后的标准状况(0 ℃、101.3 kPa)下的体积[5]。实验温度为37 ℃。

接种物的菌落结构分析与理化指标测定所涉及的主要仪器有:电热鼓风干燥箱(上海安亭)、马弗炉(沈阳节能)、PCR仪(BIORED)、DGGE(BIORED)、坩埚、电子天平、pH计(上海雷驰)、UV765紫外可见光光度计(上海精科)、酸式滴定管。

1.3 实验方法

1.3.1 厌氧污泥与发酵原料理化指标的测定 接种物的理化指标包括固形物(TS)、挥发性固形物(VS)、C、N、小分子挥发酸(VFA)、氨氮(NH4+-N)含量，以及pH值和碱度(TIC)。

1.3.1.1 TS、VS含量 采用重量法进行测定。将坩埚洗净后于干燥箱(105 ℃)内烘干,然后冷却至室温,称重，记作m1(g);根据实验材料的特性,准确称量适量样品，放置于坩埚内，一起称重,记作m2(g);随后将其放入干燥箱(105 ℃)内干燥至恒重,冷却至室温后称重，记作m3(g);再将上一步装有干燥后样品的坩埚放入马弗炉中，在550 ℃下灼烧2 h,冷却至室温后称重，记作m4(g)。TS、VS含量的计算公式如下:

(1)

(2)

VS=TS-灰分含量

(3)

1.3.1.2 C、N含量 将接种物与发酵原料(金针菇废弃物菌包)阴干，粉碎至粒径小于1 mm,采用元素分析仪进行C、N含量的测定。

1.3.1.3 pH值 取样后在30 min内采用pH计进行检测。

图6统计了贝塞尔高斯涡旋光束的光束抖动在不同各向异性的湍流大气中随传输距离的变化情况，其中各向异性参数设置分别为ξx=1，5，10和20.从图6中可以发现随着湍流各向异性参数的增大，贝塞尔高斯涡旋光束的抖动效应逐渐减弱，在远距离传输时，该现象更加明显.随着湍流各向异性参数的减小，贝塞尔高斯涡旋光束的抖动效应增强，当各向异性参数都为1时抖动效应最强，此时大气湍流谱退化为各向同性湍流谱.这是因为各向同性大气模拟的是近地大气湍流，各向异性大气模拟的是高空大气湍流，其高空大气湍流对涡旋光束相位强度的扰动要弱于近地大气湍流的扰动，因此导致了抖动效应随各向异性参数的增大而减弱.

1.3.1.4 碱度(TIC)、小分子挥发酸(VFA)含量[6]TIC、VFA采用Nordmann联合滴定法进行测定,其原理基于弱酸弱碱缓冲体系理论。即先过滤去除样品中的颗粒杂质,然后取体积为V的样品置于25 mL的高型烧杯中,采用0.05 mol/L稀H2SO4滴定至pH为5.0,记录稀H2SO4溶液的消耗量,记作V1;继续滴定至pH为4.4,记录稀H2SO4溶液的消耗量,记作V2。VFA与TIC质量浓度的计算公式为:

(4)

(5)

上式中:CVFA为VFA质量浓度(以CH3COOH计)(mg/L)；CTIC为TIC质量浓度(以CaCO3计)(mg/L)。

1.3.1.5 氨氮(NH4+-N)含量 采用纳氏试剂分光光度法[7]进行测定。先根据该方法制作氨氮的标准曲线,获得其回归方程为y=1.4621x+0.0028,R2=0.9995。

样品测定操作步骤:(1)分取适量、经絮凝沉淀预处理后的水样(使氨氮含量不超过0.1 mg),加入50 mL比色管中,稀释至标线,加1.0 mL酒石酸钾钠溶液；以下操作同校准曲线的绘制。(2)分取适量、经蒸馏预处理的馏出液,加入50 mL比色管中,加一定量的1 mol/L氢氧化钠溶液以中和硼酸,稀释至标线,加1.5 mL纳氏试剂,混匀。放置10 min后,用绘制校准曲线的相同步骤测量吸光度。(3)将第一步中的无氨水换成水样,做全程序空白实验测定。将测得的出水样吸光度减去空白实验的吸光度后,从校准曲线上查得氨氮量m。氨氮(NH4+-N)含量(mg/L)的计算公式如下:

(6)

式(6)中:m为由校准曲线查得的氨氮量(mg);V为样品体积(mL)。

1.3.2 发酵物料(金针菇菌包)基本理化性质的测定 发酵物料的基本理化指标包括固形物(TS)、挥发性固形物(VS)、C、N含量,其检测方法见1.3.1.1和1.3.1.2。

1.3.3 厌氧发酵接种物的制备 本实验以罗坊沼气站的厌氧污泥为基础,进行厌氧发酵接种物的制备,方法如下:先将厌氧污泥稀释至TS为6%左右,然后将其与活性炭(质量比1%)混合，最后将混合物装入连续厌氧发酵装置，进行连续厌氧发酵;以猪粪为原料,每天进料负荷为1 g/L,滞留期为30 d。待甲烷产量稳定,且发酵系统中各项指标(pH、TIC、VFA、NH4+-N)均符合实验要求时,罐内的反应物即为本实验所需的厌氧发酵接种物。

1.3.4 不同冷藏时间点接种物理化指标的检测 将获得的厌氧发酵接种物从发酵罐内取出,分装于5个带有氮气隔氧保护的密闭容器内(该容器带有自动排气功能,可将接种物产生的沼气排空)。其中3个处理为4 ℃冷藏组(7 d、14 d、21 d),2个处理为对照组(未处理,常温21 d)。不同处理接种物的理化指标检测方法见1.3.1。

1.3.5 不同处理接种物菌落结构的分析

1.3.5.1 基因组总DNA的提取 DNA的提取采用蛋白酶K法[8]。

1.3.5.2 PCR扩增 扩增对象为16S rDNA的V3可变区。对于古菌,引物对为：518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)、109F(5′-ACGGCTCAGTAACACGT-3′)。为了提高DGGE的分辨效率,在518R的5′端加GC(-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG

CACGGGGGG-)。

PCR反应体系:天根Mastermix 12.5 μL、引物各1 μL、模板2 μL,补加无菌ddH2O至25 μL。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。其中古菌PCR的反应条件为:94 ℃预变性4 min，然后94 ℃变性1 min,56 ℃退火37 s,72 ℃延伸1 min，最后72 ℃保温10 min,35个循环。

1.3.5.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%,细菌和古菌的变性剂浓度范围分别是35%～65%和35%～50%。在1×TAE缓冲液中,先以220 V的电压在60 ℃下预电泳10 min,然后以140 V电压在60 ℃下恒温电泳8 h。电泳结束后,进行硝酸银染色并拍照。

1.3.6 不同冷藏时间对厌氧发酵接种物的厌氧产甲烷能力的影响 采用全自动产甲烷潜力分析测试系统(AMPTSII)进行不同处理接种物的厌氧发酵产甲烷实验,每个实验处理设3个重复。发酵实验按VS接种物:VS物料=2∶1的比例启动,以累积甲烷产量、产甲烷速率及发酵启动率等为评价指标，考察不同处理接种物的厌氧发酵产甲烷能力。

2 结果与分析

2.1 实验材料(厌氧污泥、金针菇菌包)的理化指标

由表1的检测结果可知,从沼气站取回的厌氧污泥基本性状良好,VFA/TIC值为0.04(明显小于风险临界值0.4),这表明接种物中产酸菌与产甲烷菌之间的协调性良好,未有酸累积等情况发生。而接种物略微偏碱性(pH 8.11)，其氨氮值(6674 mg/L)略微偏高,这是厌氧污泥在长期的发酵过程中对猪粪物料适应的结果。因此厌氧污泥符合实验需求,但需要进行复活处理后才能用于后续实验。

当发酵原料的C/N较高时,发酵系统中微生物的生长繁殖会受到影响,使新陈代谢不充分而不能达到甲烷转化的最大值;而当C/N较低时,氮的剩余会导致过多氨(NH3)的形成,进而导致整个微生物群体的完全瘫痪。因此,将发酵物料的C/N维持在(10～30)∶1可以确保发酵系统的稳定,这也是本实验选择拥有较佳C/N(24∶1)的金针菇菌包作为发酵原料的原因。

表1 实验材料的理化指标检测结果

注:金针菇菌包为固体形态,其pH值、TIC、VFA和NH4+-N不作检测。

2.2 厌氧发酵接种物的制备结果

如图1、图2所示,当每天进料负荷VS为1 g/L时,厌氧发酵系统经过25 d的适应期后,甲烷产率与反应发酵系统的各项指标(pH、TIC、VFA、NH4+-N)也逐渐趋于稳定,而且均处于厌氧发酵所需的正常范围内，其中: pH值约为7.52; VFA/TIC=0.08,远小于系统风险临界值0.4; NH4+-N含量也由最初的3518 mg/L降低至1328 mg/L。

图1 厌氧发酵接种物的甲烷日产量及pH值的变化趋势

图2 厌氧发酵接种物在制备过程中主要指标的变化趋势

2.3 冷藏处理对厌氧发酵接种物的理化指标的影响

如表2所示,经冷藏处理后,厌氧发酵接种物的pH值与TIC值没有明显的变化,但VFA值明显降低(产甲烷菌以VFA为营养物质)，NH4+-N值明显增高(水解菌降解N源)，这表明在接种物内存在物质代谢。其中:4 ℃冷藏处理使微生物菌群进入休眠状态,减缓接种物内部营养物质的降解而维持一个相对稳定的状态;而在常温保藏条件下,微生物菌群仍以正常的生长速率消耗接种物中的营养物质,特别是随着N源的分解,接种物内NH4+-N值大幅度上升。因此,4 ℃冷冻保藏比常温保藏更能维持接种物内部环境的稳定状态。

表2 不同实验处理对厌氧发酵接种物的理化指标的影响

2.4 冷藏处理对接种物中产甲烷菌的菌落结构影响

接种物的核心是一个微生态群落,当环境改变(从发酵罐中取出)后,其菌落结构发生了相应改变(如图3所示),电泳图左侧箭头所指示的4个条带在保藏过程中逐渐消失了,这表明上述条带所代表的产甲烷菌对环境改变非常敏感;其余条带尽管仍然存在,但条带的亮度也随冷藏时间的延长而出现不同程度的下降,这表明上述条带代表的产甲烷菌尽管对环境改变具有一定的耐受力,但活性会逐渐下降。

图3 不同冷藏时间点接种物产甲烷菌的菌落结构

2.5 冷藏时间对厌氧发酵接种物厌氧产甲烷能力的影响

由表3可知：常温保藏的3个实验重复虽能正常启动,但均在产气8 d后进入停滞状态;而4 ℃冷藏则在一定程度上维持了接种物的活性,每个冷藏处理中均有1个实验重复可顺利产气；但受影响不可避免,剩余2个4 ℃冷藏实验重复基本上都在前23 d的恢复期内停止产气。就整体而言,接种物的产甲烷能力随冷藏时间的延长而下降。

表3 不同处理下厌氧发酵接种物产甲烷天数的统计结果 d

整合分析能顺利产气32 d的实验组数据,我们发现:4 ℃冷藏较常温保藏更能维持住接种物的厌氧产甲烷能力,但对该能力存有影响。如图4、图5所示,4 ℃冷藏(7、14、21 d)后的接种物在发酵中前期内的累积甲烷产量明显低于未处理的对照组;但随着厌氧发酵的进行,其累积甲烷产量呈现出逐渐追平的趋势。这表明:接种物的活性需要时间恢复,让厌氧发酵菌群从休眠状态改出,进行菌群繁殖与菌落结构的适应性调整,进而逐步恢复其厌氧产甲烷能力。而常温保藏组在产8 d甲烷后,发酵系统基本上进入停滞状态,累积甲烷产量只有冷藏处理组的一半左右。结合表2数据分析可知:接种物内部环境条件对厌氧发酵菌群的恢复有明显的影响,这也是冷冻保藏较常温保藏的优势所在。

图4 冷藏处理对累积产甲烷量的影响

3 讨论与结论

厌氧发酵接种物是沼气工程启动的关键,明确4 ℃冷藏对厌氧发酵接种物活性的影响,有助于改进接种物在保藏、运输及工程上的应用。本实验结果表明:接种物在4 ℃冷藏过程中,代表产甲烷菌的优势条带亮度随冷藏时间的延长而下降，并出现了少量条带丢失的现象;厌氧发酵产甲烷能力出现下降,前15 d的日产甲烷速率明显低于未处理组的;但冷藏处理能够减缓氨氮浓度的增高,有助于接种物的厌氧发酵活性的恢复,这是冷藏方式较常温保藏的优势所在。

图5 冷藏处理对产甲烷速率的影响

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(责任编辑:黄荣华)

Effect of Cold Storage at 4 ℃ on Activity of Inoculum for Anaerobic Fermentation

CHEN Liu-meng1, LE Xi-yi2, NIE Hong1, GUI Lun1, XIONG Jiang-hua3, YU Ying3, ZHANG Cheng1*

(1. Institute of Applied Agricultural Microorganism, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China; 2. School of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China; 3. Agricultural Environmental Monitoring Station of Jiangxi Province, Nanchang 330200, China)

In this study, the inoculum for anaerobic fermentation was stored under five different conditions formed by 3 cold (4 ℃) storage groups (7 d, 14 d, 21 d) and 2 control groups (untreated storage, room-temperature storage for 21 d), its physical and chemical properties (pH-value, VFA, TIC, and NH4+-N), colony structure and anaerobic methanogenesis ability were tested and analyzed, and the effect of cold storage at 4 ℃ on its activity was studied. The results showed that: during the cold storage of anaerobic fermentation inoculum at 4 ℃, the quantity and varieties of methanogens were declined, and their daily anaerobic methanogenesis rate at earlier 15-d stage was obviously lower than that in the untreated control group. However, the cold storage could reduce ammonia nitrogen concentration and contribute to the recovery of anaerobic fermentation activity of inoculum.

Cold storage; Inoculum; Anaerobic fermentation; Activity

2016-09-07

科技部国际科技合作项目(SQ2013Z0C500005);国家科技支撑计划项目(2014BAC04B02);江西省重大项目(20152ACF6 0023);江西省科技厅对外合作技术项目(20141BDH80018)。

陈柳萌(1981─),男,江西赣州人,副研究员,硕士,主要从事农村能源方面的研究。*通讯作者:张诚。

TQ920.6

A

1001-8581(2017)01-0102-05