一种驴和马及狐狸源性成分快速检测方法的研究

卞如如，范阳阳，刘艳艳，霍胜楠，盛清凯，谭晴晴，张全芳，张 卉，步 迅*

（1.山东省农业科学院生物技术研究中心，山东省农业科学院应用生命科学实验室，山东济南 250100；2.山东省食品药品检验研究院，山东济南 250101；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100）

一种驴和马及狐狸源性成分快速检测方法的研究

卞如如1，范阳阳1，刘艳艳1，霍胜楠2，盛清凯3，谭晴晴1，张全芳1，张 卉2，步 迅1*

（1.山东省农业科学院生物技术研究中心，山东省农业科学院应用生命科学实验室，山东济南 250100；2.山东省食品药品检验研究院，山东济南 250101；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东济南 250100）

实验旨在建立快速检测驴、马和狐狸源性成分的方法。以驴、马和狐狸的线粒体保守序列16S rRNA基因为靶基因，设计通用引物和以不同荧光素标记的特异Taq Man探针，构建与通用引物共用的阳性扩增内标（Internal Amplification Control，IAC）作为PCR监控反应体系。通过优化PCR反应体系和条件，建立能同时检测驴、马和狐狸源性成分的四重实时荧光PCR方法。结果表明：利用驴、马、狐狸、牛、猪、羊、水貂、狗、鸡、鸭、大豆、小麦、玉米等物种检测没有交叉反应，证明该方法特异性高，准确性好。该方法模板DNA检测灵敏度为0.01 ng。本研究建立的驴、马和狐狸源性四重荧光实时PCR检测体系灵敏度高、特异性强，能有效鉴别动物产品中驴、马和狐狸的源性成分，也可用作相关动物皮张真伪的鉴别方法。

16S rRNA基因；多重实时荧光PCR法；驴；马；狐狸；源性成分

驴肉享有“天上龙肉，地下驴肉”的美誉。近年来，利用廉价肉类掺假驴肉的现象层出不穷，对人类的健康造成极大威胁。为了确保食品标签真实准确，加强食品标识管理，改进食品安全和保护消费者利益，应积极开展动物源性成分检测方面的研究。目前，动物源性成分鉴别的方法主要包括物理、化学、免疫学和分子生物学方法[1]，其中以分子生物学为基础的多重实时荧光PCR法成为检测的重要工具[2]。该技术可有效地检测食品中的重要性肉类物种源性成分，包括猪肉、鸡肉、牛羊肉等[3-5]。不同物种检测范围最广的也集中于肉类检测例如对驴、马源性成分的检测[6-7]。目前，对食品中动物源性的荧光定量PCR检测研究均缺乏阳性扩增内标（Internal Amplification Control，IAC）监控反应体系，无法避免由反应抑制因素而造成假阴性结果。因此，建立添加有外源扩增内标的食品中驴肉、马肉和狐狸肉的多重荧光定量PCR检测方法对食品安全的快速监管具有重要的创新实践意义。本研究以线粒体16S rRNA基因为靶基因，分别设计驴、马和狐狸源性特异性引物和探针，成功建立了能同时检测驴、马和狐狸源性成分的多重实时荧光PCR体系，同时可适用于饲料、肉类、奶类、皮毛类和动物油脂类等动物产品中的驴、马和狐狸源性成分的鉴定。

1 材料与方法

1.1 实验材料 生熟驴肉、马肉、狐狸肉、生牛肉、生绵羊肉、生猪肉、生山羊肉、生兔肉、生鸭肉、生鸡肉、生鹅肉、生鱼肉、玉米、小麦等均购自济南市农贸市场。此外，150份驴肉产品，五香驴肉、驴肉火烧、驴肉卷、酱驴肉、驴肉香肠均购自于济南市各大超市、农贸市场等。

1.2 试剂与仪器 动物组织提取试剂盒为OMEGA品牌。TaqTMHot star Version 热启动酶、dNTPs、Mg2+、DNA分子量MakerDL 2 000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。引物与探针由生工生物工程（上海）有限公司负责合成。2×TaqMan Master Mix为DBI Bio science品牌。 DNA测序由山东省农科院生物技术中心测序中心完成。

ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，TaKaRa PCR仪为宝生物工程（大连）有限公司产品。5424 D型高速离心机为Ependorf公司产品，凝胶成像仪为BIO-RAD公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 样品DNA的提取 取待测样本50 g研磨充分混匀，取50 mg进行DNA提取，可依照动物组织提取试剂盒中的操作说明提取DNA。Nanodrop核酸检测仪检测DNA样本浓度和纯度，要求在1～ 20 ng/ μL，OD值1.7～1.8。

图1 驴、马和狐狸的同源性对比序列图

1.3.2 引物与探针的设计 从GenBank数据库中提取包括驴（NC_016061.1）、狐狸（NC_008434.1）和马（AY584828.1）的线粒体16S rRNA基因序列，利用DNAMan软件进行同源性比对（图1），利用Primer5和Primer3软件分别设计引物和探针，在3个物种的Consensus序列设计1对通用引物进行扩增，扩增片段为200 bp左右，在差异明显区设计3条特异性Taq Man探针分别针对驴、马和狐狸，以不同的荧光元素标记。要求设计的引物TM值在55～60℃左右，探针的TM值要高于引物TM值7～10℃，引物和探针序列、扩增片段大小见表1。

1.3.3 质粒的构建 构建内标过程依照参考文献[2]用Perl随机生成一段DNA序列，然后2头加上通用引物序列，使其在NCBI中BlAST后没有找到同源的DNA片段，形成针对驴、马和狐狸检测体系的竞争型内标DNA序列，长度为100 bp。将扩增内标DNA序列委托上海生工人工基因合成，合成片段连接到PMD18-T 载体上，转化感受态细胞DH5α，蓝白斑筛选，挑取白斑，测序验证，用NanodroP微量分光光度计检测质粒浓度，-20℃保存备用。用于扩增阳性内标的探针序列及内标序列见表1。

1.3.4 多重实时荧光PCR扩增体系和反应条件优化 单重PCR反应条件的确立：分别以驴、马和狐狸为研究对象，反应体系设定为20 μL，10×TaqMan Ma stermix 10 μL，对PCR反应参数包括引物浓度，探针浓度及PCR反应条件进行优化筛选。引物浓度为 10 μmol/L，用量梯度分别设为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 μL，探针浓度设为0.5、1.0、2.0、5.0 μmol/L。每次实验采取等量的模板，设定一个变量，以Ct值、荧光增量和平台期等因素作为参考依据，每个成分的浓度重复3次，若结果稳定，则可确定为最佳的浓度值。根据引物和探针的退火温度，对优化好的反应体系在“95℃ 10 min；95℃15 s；55～62℃ 35 s 45个循环”的范围内反复实验，每次实验采取等量DNA模板，每个反应条件重复实验3次，以Ct值、荧光增量和平台期等因素作为参考依据，以确定最佳的反应条件。

多重PCR反应条件的建立：按照上述单重PCR优化好的引物及探针浓度进行组合，以优化后的PCR反应条件“95℃ 10 min；{95℃ 15 s；60℃35 s} 45个循环”进行多重PCR反应，以Ct值、荧光增量和平台期及各探针的荧光信号高低等因素作为参考依据，通过调整各探针的浓度使其荧光信号高低及扩增效率尽量达到一致。

1.3.6 多重荧光PCR方法的特异性 分别从驴肉、马肉、狐狸肉、牛肉、绵羊肉、山羊肉、猪肉、兔肉、鸭肉、鸡肉、鹅肉、鱼肉、玉米、小麦中提取的基因组DNA为模板，按照上述优化的反应体系和反应条件进行荧光定量PCR，检测引物和探针的特异性，每个样本设3次平行实验。

表1 驴、马和狐狸的引物及探针DNA序列

1.3.7 多重荧光PCR方法的灵敏度使用试剂盒提取目标基因组DNA，用Nanodrop定量到50 ng，按10×梯度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），每个梯度均取2.0 μL为模板量（即10、1、0.1、0.01、0.001 ng）进行多重荧光PCR检测，确定其最低检出限，每个样本设3次平行实验。

1.3.8 多重实时荧光PCR方法重复性实验的检测 分别取纯驴、马和狐狸3个不同样本DNA为模板，按照上述优化好的体系和反应条件进行多重荧光PCR检测，每个样品进行3次复孔的独立重复实验，确定该方法的稳定性。

1.3.9 多重荧光PCR检测方法在市售样本中的实际检测应用 利用所建立的多重荧光PCR反应体系和反应条件，对150份市售的驴肉制品进行实际样本检测，验证此方法的使用价值和检测真实性。

2 结 果

2.1 单重荧光PCR检测方法条件优化 单重PCR反应条件确立：以驴、马和狐狸为研究对象，反应体系设定为20 μL，10×TaqMan Ma ster mix10 μL，对PCR反应参数包括引物浓度，探针浓度及PCR反应条件进行优化筛选。最终确立引物终浓度为0.5 μmol/L，各探针终浓度：驴探针MtlP终浓度为0.2 μmol/L，马特异性探针MtMP终浓度为0.1 μmol/L，狐狸探针MtHP终浓度为0.4 μmol/L，内标质控探针浓度0.1 μmol/L。PCR反应最佳反应条件为95℃ 10 min；{95℃ 15 s；60℃ 35 s} 45个循环。

2.2 多重实时荧光PCR反应体系建立 通过优化实验，选择优先选用20 μ L的PCR扩增体系包括：10×TaqMan Master mix 2.0 μ L，HS-Taq酶（5 U/ μL）0.2 μ L, Primer Mix（5 μ mol/L） 2.0 μ L，Probe Mix（2 μmol/L） 2.0 μ L，IAC DNA（1 pg/μ L） 1.0 μL，DNA模板（1～20 ng/ μ L）2.0 μ L，补水至20 μ L。多重荧光PCR体系可成功的检测驴、马和狐狸3种源性成分及内标质控，均出现明显的扩增曲线（图2）。

图2 引物和探针特异性结果

2.3 多重荧光PCR方法的特异性实验 通过建立的多重荧光PCR反应体系分别对14种不同物种进行特异性检测，结果显示，驴Ct值为26.32 ± 0.05，马Ct值为27.75 ± 0.02，狐狸Ct值为22.31 ±0.04，驴、马和狐狸均有扩增曲线，而其他样本均无Ct值，判定为阴性（表2）。结果表明，本研究所设计的引物和探针只对含驴、马和狐狸源性成分的物种表现出特异性，与其他检测对象无交叉反应。

表2 多重实时荧光PCR方法的特异性检测（Ct值±SD）

2.4 多重荧光PCR方法的灵敏度实验 将已测定的驴、马和狐狸基因组DNA进行10×梯度稀释后进行多重荧光PCR检测。结果显示，当驴、马和狐狸基因组DNA模板量为0.01 ng时，均能检出扩增曲线，且扩增阈值Ct值≤35；当模板用量达到0.001ng时扩增曲线极低，因此，本研究中驴、马和狐狸源性成分检出限均为0.01 ng（图3A- C）。

图3 马、驴和狐狸DNA灵敏度检测

2.5 多重实时荧光PCR方法重复性实验 采用多重实时荧光PCR方法对纯马，驴和狐狸样品进行源性成分的重复性检测，每个物种取3个DNA样品，每个样品进行3次独立重复实验。结果发现，每个样品的3次独立重复实验Ct值的标准方差均小于0.05。说明检测结果重复性好，检测稳定性高（表3）。

2.6 市售肉类样品的检测 根据优化的多重实时荧光PCR反应体系和反应条件，对市售的驴肉类样品进行实际的检测，发现市售驴肉产品检出狐狸肉和马肉成分。在30份鲜驴肉中5份检测出马源性成分，40份五香驴肉中检测出10份马源性成分和29份狐狸源性成分，20份五香驴肉火烧中检测出8份马源性成分和7份狐狸源性成分，酱驴肉中检测出7份马源性成分和9份狐狸源性成分，驴肉香肠中检测出5份马源性成分和9份狐狸源性成分，而20份驴肉卷中均未检出驴源性成分（表4）。综上可以证明此种检测方法有一定的使用价值。

3 讨 论

利用实时荧光PCR方法检测目标主要包括常见畜禽类源性成分[8-9]。我国食用驴肉的传统集中在北方地区，肉驴养殖业是我国近年来扶持的热兴养殖项目之一。截止目前，驴源性成分检测方法的研究报道较少，而利用多重实时荧光PCR同时检测驴、马和狐狸3种动物源性成分的未见报道。本研究在参考前人研究的基础上[10-12]，分别基于线粒体16SrRNA基因设计驴、马和狐狸共用的1对通用引物和各自特异性探针，同时构建能够有效指示体系中抑制剂存在的竞争性扩增内标，建立了含有扩增内标的食品中驴肉、马肉和狐狸肉成分的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。

目前，多重实时荧光PCR技术鉴定动物源性成分关键技术为靶基因的正确选择。鉴于线粒体基因组结构比较简单、稳定、分子量小，每个细胞中有1 000～10 000个拷贝，容易从组织中分离提取。现在很多学者研究了mtDNA在动物种属鉴定中的应用，与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快速、降解小（加工过程中mtDNA保持较完整）、稳定容易操作等优势。在线粒体DNA中，16SrRNA基因是线粒体基因组中研究较多的基因，为生物所共有，功能相同，既含有保守序列，又含有可变序列其序列变化与进化距离相适应，被称为进化分子钟[13]。基于动物mtDNA的PCR分子标记技术的上述特点，加之多重荧光PCR的快速、灵敏、高通量等特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广泛的应用前景。本研究基于线粒体加工过程中保持较完整和进化保守性的优势，作为目标靶基因，设计驴、马和狐狸特异引物和探针本研究结果显示多重荧光PCR体系，通过对其引物和探针特异性检测发现，该方法特异性强，与其他物种之间无交叉反应。重复性好，对鲜肉、熟肉均能得到很好的检测结果。本研究方法的建立可以实现驴、马和狐狸3种动物源性成分的快速鉴定，检出限均达到0.01 ng，具有较高的灵敏度；进一步通过对市售产品的实际检测，证明其实际的应用价值，表明该检测体系可作为市场驴源性产品有效的检测方法。

表3 多重实时荧光PCR方法检测重复性实验

表4 市售驴肉类产品检测结果

4 结 论

本研究以驴、马和狐狸的线粒体基因为靶序列，通过添加竞争型扩增内标使其在不影响体系扩增灵敏度的同时，起到有效指示假阴性的效果，从而建立的驴、马和狐狸源性四重荧光实时PCR检测体系能有效鉴别动物产品中驴、马和狐狸的源性成分，与常规PCR相比大大节约时间，操作方便，安全可靠，为其保障相关肉类、饲料、食品等产品掺假的鉴定与控制提供可靠的技术支撑。

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S814.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-01-100

2016-07-21；

2016-09-01

山东省农业重大应用技术创新课题（鲁财农指[2014] 38号）；山东省科技厅山东省优秀中青年科学家科研奖励基金计划项目 （BS2010SW024 ）；济南市高校院所自主创新项目（201401264）

卞如如（1992-），山东济宁人，研究实习员，研究方向为动物遗传学，E-mail: brr1992@163.com

*通讯作者：步迅（1964-），上海人，副研究员，研究方向为分子生物学，E-mail:sherry6423@126.com