雌激素α受体基因多态性与绝经后女性骨质疏松症相关性研究*

王 伟，曹 靖，李亚辉

(1.郑州大学基础医学院，郑州 450001； 2.郑州大学人民医院 急诊创伤外科，郑州 450003；3.河南医学高等专科学校 检验系 郑州 451191)

雌激素α受体基因多态性与绝经后女性骨质疏松症相关性研究*

王 伟1,2，曹 靖1△，李亚辉3

(1.郑州大学基础医学院，郑州 450001； 2.郑州大学人民医院 急诊创伤外科，郑州 450003；3.河南医学高等专科学校 检验系 郑州 451191)

目的 探讨雌激素α受体基因(ERα)中rs9340799、rs2234693和rs3798577多态性与绝经后女性骨质疏松症的相关性 。方法 收集2014年2月—2015年10月在该院住院确诊为骨质疏松症的142名绝经后女性患者为观察组，收集同时期住院的年龄匹配的未患骨质疏松症的151名绝经后女性患者为对照组，并使用聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)方法检测ERα基因rs9340799, rs2234693和rs3798577多态性。结果 与对照组比，ERα基因rs2234693 CT和CC基因携带者可分别提高绝经后女性骨质疏松患病风险2.331倍(P=0.031)和3.606倍(P=0.001)。ERα基因rs3798577 TT基因型携带者可提高绝经后女性骨质疏松患病风险2.222倍(P=0.022)。rs9340799多态性位点各基因型在观察组与对照组间频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。携带有rs9340799-rs2234693-rs3798577-ATT单体型会增加绝经后女性骨质疏松风险(P<0.001)，而携带rs9340799-rs2234693-rs3798577-ACC单体型会降低绝经后女性骨质疏松风险(P<0.001)。经多因素logistic 回归分析结果显示，rs2234693的CT/CC基因、糖尿病和总胆固醇≥5.2 mmol/l是绝经后女性骨质疏松症发生的危险因素。结论 ERα基因rs2234693多态性与绝经后妇女骨质疏松症明显相关。

雌激素α受体基因；骨质疏松症；绝经；多态性；rs2234693

骨质疏松症是以骨密度降低和骨结构破坏为主要特征的一种代谢性骨骼疾病，患者具有较高的脆性骨折风险，该病在绝经后女性中较为常见。骨质疏松症病因是多因素的，主要与老龄化、激素水平、环境因素和遗传因素有关，大量同卵双生双胞胎家族中研究显示遗传因素在其发病中占决定性因素，约占60%～70%[1]。目前大量研究表明，雌激素内分泌系统可以调节成骨细胞的基因表达和抗氧化作用而防止骨量丢失，雌激素内分泌系统在调控骨密度方面起着重要作用[2]。雌激素主要通过与α受体结合发挥作用，雌激素α受体基因(ERα)多态性将影响体内雌激素活性，雌激素活性的降低会造成绝经后女性骨密度的下降，最终出现绝经后女性骨质疏松症。因此，雌激素α受体基因(ERα)被认为是决定骨质疏松危险性的重要候选基因[3],但是该结果在不同地区和不同人群中不尽相同，目前仍有较大争议。

本研究对河南142名绝经后女性骨质疏松症患者的ERα基因3个单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphisms ,SNPs)位点进行了检测，来明确ERα基因启动子区多态性与绝经后骨质疏松症的相关性, 为临床合理防治女性绝经后骨质疏松症提供理论依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象 2014年2月—2015 年10月间在河南省人民医院住院患者中，选取142例无亲缘关系的汉族绝经后女性原发性骨质疏松患者。所有患者均排除继发性骨质疏松，患有影响骨代谢的疾病(如营养不良和骨肿瘤等)和长期服用影响骨代谢药物。骨质疏松症的诊断按国际骨质疏松症的诊断标准(双能X线测得骨密度值≤青年健康人群骨密度-2.5SD)[4]。151例对照组为进行骨密度测定的该院住院绝经后女性患者，骨密度检测结果显示无骨质疏松症(双能X线测得骨密度值> 青年健康人群骨密度-1.0SD)。本研究对象均签署知情同意书,研究经过医院伦理委员会批准。

1.2 临床资料 从患者病历中收集所有研究对象的姓名、住院号、年龄、籍贯、既往史、绝经年限、身高、体重(计算BMI 值)等，并利用该院临床检验报告系统收集研究对象的血钙(Ca)、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等各项数据。

1.3 骨密度检测 使用美国豪诺士公司生产的Hologic QDR-4500W 型双能X线骨密度仪检测患者正位腰椎(L2-L4)的骨密度(g/cm2)，并记录患者腰椎T-score 和Z-score。所有患者骨密度测定均由同一技术员操作。

1.4 基因组DNA的提取 取受试者EDTA抗凝外周静脉血1 mL，按照DNA提取专业试剂盒(北京天为时代公司提供)说明书操作，提取外周血淋巴细胞的DNA，-20℃保存备用。

1.5 雌激素α受体基因(ERα)多态性检测 所有被试者的外周血DNA委托上海捷瑞生物工程有限公司使用聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)方法，对ERα基因rs9340799, rs2234693和rs3798577多态性位点进行检测。方法如下：应用特异性引物分别扩增含有上述多态性位点的DNA片段。随后PCR扩增产物与LDR探针杂交，在连接酶作用下进行LDR反应形成含荧光标记的LDR产物。LDR反应条件: 94 ℃预变性2 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 4 min，25个循环。LDR产物用ABI 377 DNA测序仪进行测序分型，并随机选取PCR产物进行直接测序以验证LDR分型的准确性。

1.6 统计学分析 采用 SPSS 18.0 统计软件(SPSS, Inc, Chicago, IL, USA)分析数据。计量资料以(x±s)表示，组间比较用t检验，计数资料组间比较用χ2检验，并计算相应的OR值和95%的置信区间(CI)。多因素Logtics回归分析校正骨质疏松的混杂因素，检验水准α=0.05。雌激素α受体基因(ERα)三个多态位点的单体型(haplotype)分析使用SHEsis在线平台 (http://analysis.Bio http://analysis2. bio- x.cn/ myAnalysis.php)[5]。

2 结果

2.1 两组患者各项临床基本资料比较 观察组和对照组年龄、BMI、血钙、血脂等各项临床基本资料(表1)。BMI、胆固醇、糖尿病、空腹血糖(FBG)和腰椎L2-L4骨密度(BMD)在骨质疏松患者和对照组之间差异具有显著统计学意义(P<0.05)，其他各项指标在两组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 绝经期骨质疏松患者和对照临床基本资料情况比较 (x±s)

2.2 两组ERα基因多态性分布比较 本研究在观察组和对照组中ERα基因3个多态性位点(rs9340799, rs2234693和rs3798577)基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。见表2。在rs2234693基因型中，与CC基因型相比CT基因型骨质疏松患病风险提高2.331倍(95%CI:1.066-5.079,P=0.031)，TT基因型骨质疏松患病风险提高3.606倍(95%CI:1.671-7.781,P=0.001)，CT+TT基因型骨质疏松患病风险提高2.953倍(95%CI:1.148-6.150,P=0.002)，携带T等位基因骨质疏松患病风险与C等位基因相比提高1.889倍(95%CI:1.331-2.680,P<0.001)；在rs3798577基因型中，与CC基因型相比TT基因型骨质疏松患病风险提高2.222倍(95%CI：1.117-4.421，P=0.022)，携带T等位基因骨质疏松患病风险与C等位基因相比提高1.477倍(95%CI:1.056-2.066,P=0.028)；在rs9340799基因型中，各基因型和等位基因中骨质疏松患病风险未见显著提高(P>0.05)。

2.3 两组ERα各基因型单体型频率分布比较 采用SHEsis在线软件平台对ERα 3个多态性位点构建单体型，频率低于0.03的单体型未纳入统计。rs9340799, rs2234693和rs37985773个SNPs位点可构建6种单体型：H1-ATC，H2-ACT，H3-ATT，H4-GTT，H5-GCC和H6-ACC。H3-ATT 单体型在观察组与对照组中频率分别为0.176和0.063，两者差异有统计学意义(P<0.001)，携带H3-ATT 单体型会增加绝经后女性骨质疏松风险(OR=3.166 ，95%CI： 1.804-5.556)。H6-ACC单体型在观察组与对照组中频率分别为0.046和0.145，两者差异有统计学意义(P<0.001)，携带H6-ACC 单体型会降低绝经后女性骨质疏松风险(OR=0.126 ，95%CI：0.054-0.296)。其余单体型(H1，H2，H4和H5)在观察组与对照组之间分布频率差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2 两组ERα各基因型和等位基因频率分布比较[n(%)]

表3 两组ERα各基因型单体型频率分布比较

注：单体型顺序：rs9340799- rs2234693-rs37985773,Global X2 is 2.158, df=5,P=0.3347。

2.4 多因素对绝经后女性骨质疏松发生的影响 以研究对象是否出现骨质疏松为因变量Y，研究对象的年龄、绝经年龄、BMI、血钙、血脂、糖尿病、高血压、ERα基因型等指标为自变量X，进行多因素logistic 回归分析。使用“backward LR”方法logistic 回归分析后共有5个自变量rs2234693、rs3798577、BMI、总胆固醇和糖尿病纳入回归分析，最终筛选出rs2234693、总胆固醇和糖尿病为影响绝经后女性骨质疏松的危险因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响绝经后女性骨质疏松因素的logistic 回归分析

3 讨论

雌激素α受体(ERα)基因位于6号染色体长臂6q 25.1，长度约为140 kb，含有8个外显子和7个内含子。雌激素α受体( ERα) 基因多个多态性位点已被认为对骨量和骨代谢具有显著影响，其中研究最多的是第二外显子上游的 rs2234693 T/C(PvuII)和第二外显子下游 rs9340799 A/G(XbaI)两个多态位点[6]。最近的一项研究显示，在印度绝经后和绝经前妇女中rs9340799多态位点 AA基因型(xx)和rs2234693 多态位点TT基因型(pp)在骨质疏松患者中的频率明显高于对照组(P<0.001),并且携带有这些基因型的患者腰椎骨密度值(BMD)和血清中雌二醇的浓度也显著低于携带rs9340799 GG基因型(XX)和rs2234693 CC基因型(PP)(P<0.05)[7]。在土耳其女性[8]，西班牙绝经后女性[9]和约旦绝经后女性[10]也发现相似的研究结果，以上研究提示rs9340799(XbaI)和rs2234693(PvuII)多态位点与绝经后妇女骨质疏松有直接关联。本研究中笔者也发现rs2234693(XbaI)多态性与河南绝经期女性有直接关联， rs2234693 CT基因型和TT基因型可增加骨质疏松患病风险提高2.331倍和3.606(P=0.031和P=0.001)，携带T等位基因人群骨质疏松患病风险与C等位基因相比提高1.889倍(P<0.001)。但是本研究中未发现rs2234693(PvuII)多态性位点与骨质疏松有直接关联，与上述研究结果不尽相同，各基因型分布在骨质疏松组和对照组中分布差异无统计学意义(P>0.05)，多因素logistic回归分析后rs2234693也未纳入回归分析中，提示rs9340799(XbaI)多态性位点与河南绝经后女性骨质疏松发生也无直接关联。此结果与2012年 Wang等的一篇关于ERα基因的rs9340799(XbaI)和rs2234693(PvuII)多态性与骨质疏松的meta分析研究结果相一致，rs9340799(XbaI)XX主要在西方女性中对骨质疏松发生有一定保护作用，而不是东方人群[11]。

rs3798577位于ERα基因的3’-UTR区，T>C的突变会导致ERα活性变化[12]。大量研究已发现rs3798577多态性C等位基因会降低亚洲人群乳腺癌的发病风险(OR=0.828, 95%CI: 0.730-0.939)，而在欧洲人群中C等位基因会增加欧洲人群乳腺癌的发病风险(OR=1.551, 95%CI: 1.0372.321)[13]。目前国内外尚无rs3798577多态位点与绝经后女性骨质疏松关联的研究报告，在本研究中笔者发现与C等位基因相比，携带rs3798577多态性T等位基因人群的骨质疏松患病风险会提高1.477倍(95%CI:1.056-2.066,P=0.028)，另外rs9340799-rs2234693- rs3798577三个SNPs构建单体型分析也显示：携带H3-ATT单体型会增加绝经后女性骨质疏松风险(OR=3.166 ，95%CI: 1.804-5.556)，携带H6-ACC单体型会降低绝经后女性骨质疏松风险(OR=0.126 ，95%CI:0.054-0.296),以上研究结果说明了rs3798577多态性可能也与汉族绝经后女性骨质疏松有着直接关联。但是经过多因素logistic回归分析后rs3798577(CC Vs.CT+TT)增加绝经后女性骨质疏松发病风险无统计学意义(P=0.212)。因此将来需要更多的来源于不同地区人群和更大的样本量的研究来明确rs3798577多态性与绝经后女性骨质疏松的关系。

总之，本研究从分子流行病学角度探讨了ERα基因rs2234693多态性位点与绝经后妇女骨质疏松发病之间的具有显著关系。另外，多因素logistic回归分析绝经后女性骨质疏松危险因素除了rs2234693多态性以外，高总胆固醇血症和糖尿病患者可能也是绝经后女性罹患骨质疏松症的危险因素。

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[责任编校：柯 莉]

Association between Estrogen Receptor Alpha Gene (ERα)Polymorphism and Osteoporosis in Postmenopausal Women

WANG Wei1,2,CAO Jing1,LI Ya-hui3

(1.PreclinicalMedicineCollegeofZhengzhouUniversity,ZhengzhouHenan450001,China; 2.DepartmentofEmergencyTraumaSurgery,People’sHospitalofZhengzhouUniversity,ZhengzhouHenan45003，China; 3.DepartmentofMedicalLaboratory,HenanMedicalCollege,ZhengzhouHenan450003,China)

Objective To investigate the relationship between estrogen receptor alpha gene (ERα)polymorphisms (rs9340799, rs2234693 and rs3798577)and osteoporosis in postmenopausal women．Methods Between February 2014 and October 2015, a total of 142 postmenopausal female patients with osteoporosis and 151 age matched inpatients without osteoporosis women were recruited in Henan Province People’s Hospital. ERα gene polymorphism were determined to all subjects by PCR-LDR.Results When compared to controls, rs2234693 CT and CC genotype were associated with increasing the risk of osteoporosis in postmenopausal women (OR=2.331,P=0.031 andOR=3.606,P=0.001, respectively).Rs3798577 TT genotype was also associated with increasing the risk of osteoporosis in postmenopausal women (OR=2.222,P=0.022). While no significant differences were found between rs9340799 polymorphisms and osteoporosis in postmenopausal women (P>0.05). In addition, rs9340799-rs2234693-rs3798577-ATT haplotype was associated with the increased risk of osteoporosis in postmenopausal women (P<0.001), but the rs9340799-rs2234693-rs3798577-ACC haplotype was associated with reduced risk of osteoporosis in postmenopausal women (P<0.001).Multi-factor logistic regression analysis showed that rs2234693 CT and CC genotype, diabetes and total cholesterol(TG)≥5.2 mmol/L were the risk factors for osteoporosis in postmenopausal women.Conclusion Estrogen receptor alpha gene (ERα)rs2234693 polymorphism may contribute to the susceptibility of osteoporosis in postmenopausal women．

estrogen receptor α gene； osteoporosis； postmenopausal； polymorphism； Rs2234693

2016-10-10

王 伟(1972-)，男，河南省嵩县人，本科，主治医师，从事急诊创伤外科专业工作。

河南省教育厅2015《骨质疏松性椎体压缩骨折椎体后凸成形术后再发骨折之析因研究》(批准号：15A320078)。

R 711.75

A

1008-9276(2017)01-0011-05

△通讯作者：曹 靖， E-mail: caojing73@126.com。