大灰象甲性信息素分离鉴定及方法研究

李建文，李 晓，孙文秀*，李 伟，鞠 倩，曲明静*，高华援，李春雨

(1.长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025； 2.山东省花生研究所/农业部花生生物学与遗传育种重点实验室，山东 青岛 266100； 3.吉林省农科院花生研究所，吉林 长春 130124)

大灰象甲Sympiezomiasvelatus(Chevrolat)，又名大灰象、大灰象虫、象鼻虫，属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)斑鄂象甲亚科(Brachyrhininae)灰象属(Sympiezomias)。主要分布于吉林、辽宁、甘肃、宁夏等地区，是花生的重要害虫之一。大灰象甲食性杂，除花生外，该虫还危害棉花、甜菜、玉米等多种农作物[1-4]。2016-2017年连续两年，该虫在东北吉林花生产区均有严重危害，以成虫潜入土壤土表取食嫩根、叶片，导致虫洞、烂叶，缺苗断垄以至绝收，严重田块缺苗60%以上[5-9]。

昆虫性信息素是由昆虫某一性别个体分泌于体外，能被同种异性个体所接受，并引起异性个体产生一定的行为和生理反应(如觅偶、定向求偶、交配等)的微量化学物质，作为昆虫交配过程中两性相互寻找的重要纽带和必备因素，因其专一、高效、持久、无毒、无污染、不伤害天敌等特点，近年来受到高度重视[10]，目前已有学者分离鉴定出多种鞘翅目昆虫的性信息素组分[11-12]，甚至实现了田间应用。然而大灰象甲的性信息素研究工作未见任何报道，防治仍以传统农药为主，随着昆虫抗药性隐患以及对环境污染的加剧，大灰象甲性信息素的研究工作迫在眉睫；同时，在国家化肥农药减量施用的大背景下，利用性信息素防治害虫也呈现出广阔的应用前景。在昆虫性信息分离鉴定技术中，固相微萃取技术具有操作简便、不需溶剂、萃取速度快、便于实现自动化以及易于色谱分析、需要样品量少等特点，较适用于大灰象甲等性腺体不明的昆虫类性信息素的分离鉴定。大灰象甲生活史长，在东北地区两年发生一代，暂未实现人工饲养，因此性信息素取样工作是在每年发生高峰期采集田间试虫进行抽提，带回室内进行气质分析。为探索田间取样方法，本研究采用直接萃取法和气密针取样法进行对比研究，旨在为下一步的性信息素分离鉴定工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

于2016年6月大灰象甲成虫出土初期，采自吉林省扶余市弓棚子镇花生产区，将田间采集的大灰象甲收集起来，雌雄分开，分组饲养在花生植株上，试验时用玻璃罩隔离。

1.2 供试材料

试验所用的玻璃罩采用长、宽、高分别为17cm×17cm×25cm长方体玻璃罩，使用前用蒸馏水及无水乙醇分别清洗三次后置于180℃下烘烤5 h；试验所用的固相微萃取探针采用ZZ-SPME-06型萃取针以及DVB/CAR/PDMS型萃取头；气密针为润泽流体100mL型；气密袋采用海得科技MBT32-1型铝塑复合气体采样袋。

1.3 取样方法

1.3.1 直接萃取法

选取正在交配的大灰象甲10对，非求偶期大灰象甲10对作为对照，分别用长方体玻璃罩将其隔离起来，将固相微萃取探针悬挂于玻璃器皿内萃取30 min后保存于冰盒内带回实验室备用，实验重复8次。

1.3.2 气密针采集法

选取正在交配的大灰象甲10对，非求偶期大灰象甲10对作为对照，分别用玻璃器皿将其隔离起来，每隔5 min用气密针采集器皿内气体100 mL注入气密袋，采集6次，30 min后将气密袋带回实验室，用固相微萃取探针萃取1 h，萃取探针保存于冰盒内备用，实验重复8次。

1.4 GC-MS分析

将上述两种方法保存的固相微萃取探针分别送入安捷伦7890A/5975C型气相色谱—质谱联用仪(青岛贞正分析仪器有限公司)进行分析，进样口温度为220℃不分流，柱温升温程序为40℃，保持2 min，5℃/min升至100℃，再以10℃/min升至250℃，保持2 min，传输线为250℃，MS为35～400 m/z，解析时间为5 min。

1.5 统计学分析

所有数据采用Excel 2010和SPSS 19.0软件进行处理及统计分析，采用Origin 7.5软件进行绘图。

2 结果与分析

从GC-MS分析结果来看，两种方法共检出46种化合物(表1)，保留时间集中在7.40～30.32 min之间。两种方法均能检测到的化合物有5种，分别为：乙苯(Ethylbenzene)、对二甲苯(p-Xylene)、苯乙烯(Styrene)、1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2- tetrachloroethane)和苯酚(Phenol)。大多数化合物为含有双键或三键的直链不饱和烯炔烃、带环的酸酯、醇酯以及醛、酮类化合物。直接萃取法共检出37种化合物(表2)，保留时间集中在7.78～30.32 min之间。在交配组样本中单独检测到的化合物有24种，交配组和对照组中均检出的化合物有13种。交配组含量显著高于对照组的物质有4种(图1)，分别为癸醛(Decanal)、香橙烯氧化物(2)(Aromadendrene oxide-(2))、丁羟甲苯(Butylated Hydroxytoluene)和3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷(3-ethyl-5-(2-ethylbutyl)-octadecane)，其中癸醛、香橙烯氧化物(2)和3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷三种化合物的差异性达到极显著水平。气密针采集法检出化合物14种(表3)，保留时间集中在7.40～23.68 min之间。在交配组大灰象甲的气体样本中单独检测到的化学物质有2种，分别为壬醛(Nonanal)和2-壬烯-1-醇(2-Nonen-1-alcohol)；交配组和对照组样品中均检测到的化合物有12种，其中交配组含量高于对照

组的物质有10种，其中差异性达极显著水平的有8种，分别为乙苯(Ethylbenzene)、对二甲苯(p-Xylene)、1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2-tetrachloro-ethane)、苯酚(Phenol)、(E)-2-壬烯-1-醇( (E)-2-nonen-1-alcohol)、十四烷(Tetradecane)、4,4,5,6-四甲基四氢-1,3-恶嗪-2-硫酮(4,4,5,6-tetramethyltetrahydro-1,3-oxazin-2-thione)和癸酸癸酯(Decanoic acid decyl ester)(图2)。

3 讨 论

本文首次将固相微萃取技术应用于大灰象甲性信息素分离鉴定，对取样方法及性信息素组分进行了探索，由于大灰象甲尚未实现人工饲养，取样前处理较为困难。本实验采用直接采样法和气密针采样法对大灰象甲的性信息素取样，均能采集到一定数量的化合物，但种类与含量有较大差别。其中直接采样法采集到37种化合物，种类较多，平均保留时间在15～30 min之间的化合物占73.0%；气密针采样法采集到14种化合物，平均保留时间为10～24 min的占比71.4%。两种方法均分离到的化合物为乙苯、对二甲苯、苯乙烯、1,1,2,2-四氯乙烷和苯酚。分析两种取样方法导致化合物组分的差异，主要有以下几个原因：其一，直接采样法将萃取探针直接悬挂在玻璃器皿内，萃取探针可能会吸附到土壤及花生植株释放的气味组分；其二，田间采样萃取探针萃取后，探针需要在低温环境下运输至室内上样，这个过程可能会导致已萃取的化合物释放或重萃取，导致一些无关组分的产生。而气密针采集法将气体采集到气密袋中带回实验室萃取减少了上述可能无关化合物的干扰，因此更适于大灰象甲性信息素气体样本采集。此外，在花生田大背景下，无论何种方法都不能完全避免无关气体化合物对实验结果造成的干扰，因此下一步试验应尽量避免花生植株带来的背景噪音。

对两种方法分离鉴定到的性信息素组分进行分析发现，采集到的含苯环的化合物占30.43%，酯类化合物占23.91%，含醇类化合物占13.0%，酸类化合物占10.87%，其余的为长链烷烃以及少数醛酮类化合物。其中交配组与对照组均采集到的化合物中对二甲苯、1,1,2,2-四氯乙烷、苯酚等化合物的峰面积值较高，分析与土壤中残留农药助溶剂中的甲苯、二甲苯以及含氯化合物有关[13-14]，而不是大灰象甲的性信息素组分。以往研究结果表明，昆虫性信息素大部分是由两种以上的化学物质组成，链长一般为10～21碳，其中以12、14、16个碳原子居多，除了双键外，大多数化合物一端有一个官能团，鞘翅目昆虫性信息素组分多含有烯烃取代基，如树莓象甲的性信息素组分有苎烯和α-蒎烯，蔓越橘象甲对(Z)-2-(3,3-二甲基-环己亚基)乙醇、(Z)-(3,3-二甲基环己亚基)乙醛和(E)-(3,3-二甲基环己亚基)乙醛敏感以及甘薯象甲性信息素组分含有[(Z)-3-十二碳烯基(E)-2-丁烯酸酯]等[15-17]。近缘种尤其是同属种昆虫性信息素结构上有较大的相似性，因此，将大灰象甲性信息素组分的排查重点锁定在含烯烃取代基的醇酯类化合物中，如：双环[4.2.0]辛-1,3,5-三烯、10,12-十八碳二烯酸、E-12-甲基-2,13-十八碳二烯-1-醇、1,3,5,7-环辛四烯、香橙烯氧化物(2)、7-甲基-Z-十四碳烯-1-醇乙酸酯、2-壬烯-1醇、(E)-2-壬烯-1醇、9-十六碳烯酸等化合物，这对后期鉴定和验证大灰象甲性信息素有一定的借鉴意义。

昆虫性信息素是一类分泌极少的化学物质，这使得微量成分的常规化学分析和检测都很难，仅通过简单的采集鉴定难以确定性信息素的具体成分[18-20]，要明确大灰象甲的性信息素组分还需要后期改进实验方案、进一步进行电生理和风洞等实验验证与鉴定。

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