鱼类人工多倍体育种及其在水产养殖中的应用

王延晖

（河南省水产科学研究院，郑州 450044）

鱼类染色体的特点之一，是具有较大的可塑性，易于加倍，这是人工诱导多倍体技术的理论基础。鱼类人工多倍体育种就是通过增加染色体组的方法来改造生物的遗传基础，从而培育出符合人们需要的优良品种的育种方法。

多倍体育种方法简单，技术可行，易于操作，与性控、选育等技术结合可以生产具有生长速度快、抗病力强、成活率高和饲养管理方便的新品种。多倍体育种的研究进展较快，许多品种已应用于生产，取得了明显的经济效益。中国自20世纪70年代中期开始鱼类多倍体育种工作，迄今已获得草鱼、鲤鱼、鲢鱼、虹鳟、鲫鱼、大鳞副泥鳅、牙鲆等 20余种鱼类的三倍体或四倍体试验鱼，其中三倍体的异育银鲫、湘云鲫、湘云鲤已进入实用化生产阶段。

1 鱼类人工诱导多倍体机理及方法

1.1 人工诱导多倍体的细胞学机制

多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的。鱼类受精细胞学研究表明：鱼类精子入卵的时期是第二次减数分裂的中期，卵子受精后放出第二极体。如果卵子在各种理化因子刺激下不排出第二极体，与单倍体精子结合就形成三倍体；若受精后第一次有丝分裂受到抑制，则单倍体的精子、卵子结合后再经过染色体加倍就产生四倍体鱼类。

1.2 人工诱导多倍体的方法

目前，鱼类多倍体的诱导方法主要有生物、物理和化学方法。

1.2.1 生物学方法

人工诱导多倍体的生物学方法主要有远缘杂交、核移植和细胞融合等。应用较多的是远缘杂交法。

远缘杂交主要是借助于异源精子的不亲和性而诱发染色体倍数增加，产生异源三倍体或四倍体。远缘杂交技术易操作，应用较为广泛。鲤科不同亚种之间的远缘杂交，往往可以产生多倍体。鳙(♂)×草鱼(♀)杂交会产生三倍体杂种鱼，其F1全部具有三倍染色体数(3n=72)。

此外还有核移植和细胞融合。核移植技术精细、难度大，故通过核移植获得多倍体的方法还处于初始阶段；细胞融合是在人工诱导下，将两个不同基因型的细胞融合成一个杂种细胞的方法。但由于细胞内染色体发生重排，实际得到的是各种不同数量染色体的细胞群。通过这两种方法并未成功地获得真正意义上的多倍体，仅得到心跳期胚胎或嵌合体仔鱼。

1.2.2 物理方法

物理方法是利用物理手段抑制鱼类受精卵细胞正常分裂，获得多倍体后代的方法。目前最常用的包括温度休克法（冷休克和热休克）、静水压法、高盐高碱法等。

温度休克法是将受精卵短时间置于略高于或略低于致死温度的冷或热环境中，引起受精卵细胞内代谢相关酶构型的改变，不利于酶促反应的正常进行，使得受精卵发育延迟，从而抑制第二极体排放或抑制第一次卵裂，诱导出三倍体或四倍体鱼。根据处理温度分为冷休克（0～5℃）和热休克（35～42℃）两种方法。一般来说，冷水性鱼类宜用热休克，温水性鱼类宜用冷休克。影响温度休克法的关键因素包括处理的开始时间、持续时间以及温度高低，鱼类温度休克敏感性的差异既与遗传背景有关，也与卵子成熟度有关。

静水压法采用较高的水静压(650 kg/cm2)来抑制第二极体的放出或者抑制第一次卵裂，诱导产生多倍体。该方法最佳条件易于掌握，处理程序易于标准化，对受精卵的损伤小，诱导率高(一般在90～100%)。但需专门的设备如水压机等，同时样品室容量有限，不适宜大规模生产。

高盐高碱法是利用高盐或高pH条件诱导鱼类多倍体的方法，其诱导机理尚不明确，容易产生较高畸形率，故应用较少。

1.2.3 化学方法

化学方法是利用化学诱导剂抑制鱼类受精卵正常分裂，产生多倍体后代的方法。常用的诱导剂包括细胞松弛素 B（CB）、聚乙二醇（PEG）、6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）、秋水仙素、咖啡碱等。这些化学药物通过阻止分裂沟的形成、抑制细胞质的分裂，阻止了极体的释放而形成多倍体。

化学药品一般较贵，而且有毒性，对生成个体的活性有负面影响，往往得到较大比例的嵌合体，有一定的局限性，不如温度休克与静水压处理诱导鱼类多倍体使用普遍。

2 多倍体的鉴定

无论采用何种诱导方法,都不能达到100%的诱导率，且所形成的多倍体常常表现为嵌合体，因此诱导结果必须经过严格的鉴定。常用的鱼类倍性鉴定方法包括染色体计数、DNA含量测定、红细胞测量及其他现代生物技术方法等。

染色体制片直接计数法是通过对有丝分裂旺盛组织制备染色体标本，对染色体数目进行统计和核型配对确定其倍性的方法。该方法是鱼类多倍体鉴定中最直接和精确的鉴定方法。不仅可以检测细胞倍性，还可以检测出多种细胞倍性形成的嵌合体。但该方法最大的缺点是制片过程繁琐，需要对实验鱼进行连续2～3次注射诱导药物。同时，需要对实验鱼进行解剖取材，产生不可逆的损伤。

细胞核内DNA含量是由物种本身所决定的，鱼类体细胞倍性增加，其DNA含量也随之增加。利用核酸特异性结合荧光染料（PI或DAPI）对鱼类体细胞进行染色，流式细胞仪检测其荧光信号强度，从而鉴定其倍性。该方法具有取样量少，倍性鉴定灵敏度高等优点，且不会对实验鱼产生不可逆损伤，是目前较为先进可靠，利用最为广泛的方法，但此方法需要专门的仪器设备，检测费用昂贵。

鱼类的红细胞大小通常与其倍性成正比，倍性越高，红细胞体积越大，可通过红细胞体积测量来判断其倍性。该方法取材简单，操作简便，对鱼体伤害小，可作为鱼类倍性鉴定的初步筛选方案。

现代分子生物学方法如mtDNA遗传多态性检测、RAPD技术、DNA斑点杂交技术等均可以检测多倍体中外源片段的掺入。

3 多倍体技术在鱼类养殖中的应用

多倍体鱼类对改善品质、加快生长速度、延长寿命、提高产量、控制过度繁殖、保持物种多样性、培育新品种等方面都具有重要意义，应用于水产养殖可以带来巨大的经济效益。

3.1 提高杂种后代成活率，提高生长速度

性腺不育的三倍体鱼类，在耐水污染、耐寒和抗病性等抵抗恶劣环境方面具有明显的优势。褐鳟、溪红点鲑的三倍体杂种在开口摄食时成活率为78.8%，而二倍体杂种的成活率仅为23.7%，在幼鱼期和成熟期三倍体普遍比二倍体生长快。

3.2 延长养殖周期，改善品质，提高经济效益

多倍体不育的鱼因无需消耗能量用于生殖腺的发育，因而可将更多的营养物质用于生长，提高饵料转化率和产量。不仅避免因性腺发育繁殖而造成的肉质退化、生长停滞、产后染病死亡等不良现象，还会提高生长速度，明显地改善鱼肉的品质。

3.3 控制过度繁殖，保持物种多样性

三倍体的不育性可以减少鱼类基因之间的混杂，可有效控制自然水域中鱼类的混乱杂交和过度繁殖，避免养殖品种的退化，保存当地物种的多样性。因此也可用于控制引种对环境的影响。

3.4 培育鱼类新品种

多倍体技术目前比较成熟的是三倍体，但三倍体鱼是不育的，苗种不能大规模生产。而四倍体鱼类是可育的，且有4个等位基因，染色体重组形式多、变异性大，在遗传育种上具重要意义。将四倍体与正常二倍体杂交便可大量生产三倍体。另外，从四倍体还可获得四倍体(自交)、更高倍数体以及结合雌核发育、雄核发育技术得到雌核或雄核发育二倍体。

[1]范兆廷等.鱼类中的多倍体.动物学杂志，1985，（20）：52-57．

[2]朱传忠，邹桂伟．鱼类多倍体育种技术及其在水产养殖中的应用．淡水渔业，2004，34(3)：53-56．

[3]王炳谦，范兆廷等.虹鳟杂交胚胎（2n♀×3n♂）的发育状况及其DNA倍性分析.中国水产科学，2011，8（6）：1321-1326．

[4]刘金相，王旭波等.静水压法人工诱导牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交三倍体的探索.中国海洋大学学报，2014,44（2）：41-47．

[5]许建和，尤锋等.冷休克法和静水压法人工诱导大黄鱼三倍体.中国水产科学，2006,13（2）：207-210．

[8]林琪，吴建绍.三倍体大黄鱼的诱导及其对生长、性腺发育的影响.水产学报.2004,28(6),728-732．

[9]李文龙，陈松林等.半舌滑鳎四倍体鱼苗的诱导与鉴定.中国水产科学.2012,19(2):196-201．