大豆可溶性多糖对大豆分离蛋白的物性修饰*

齐军茹 曹静 程萌 翁静宜 张曦 杨晓泉

(华南理工大学 食品科学与工程学院, 广东 广州 510640)

基于Maillard反应机理的蛋白质和多糖糖基化研究是蛋白质化学改性的一种绿色有效方法,因其具有较高的接枝度和安全性而广泛应用于食品工业中[1- 3].该方法通过控制温度和相对湿度[4- 5]产生自发的Maillard反应,生成的糖基化蛋白的溶解性、乳化性、凝胶特性、抗氧化性、抗菌性以及热稳定性等性能均有提高[6- 11].通过Maillard反应得到的蛋白质-多糖糖基化产物的性质主要依赖于蛋白的结构和多糖的性质,例如,亲水性、黏度、分子链长和参与糖基化反应的数量[12].

近年来,国内外该研究领域中所涉及的多糖多为中性多糖,如葡聚糖,以及其他小分子的多糖.Diftis等[5、13- 15]对大豆分离蛋白与多糖(葡聚糖、羟甲基纤维素)的共价接枝产物做了一系列研究.但是,制备产物未能获得更加理想的物化性质.随着多糖研究的迅速发展,可溶性大豆多糖作为一种绿色的食品添加剂受到关注.与葡聚糖不同,大豆可溶性多糖(SSPS)是一种酸性多糖,半乳糖醛酸主链上分布着阿拉伯糖中性侧链[16],结构类似于果胶,并且具有调节血糖值和血液脂质、促进肠道有害物质的吸附与排泄、抗癌、促进矿物质吸收利用[17]等生物活性.研究表明,SSPS在酸性条件下具有良好的分散稳定性,具有稳定低黏度乳酸饮料的效果[18].这主要是由于SSPS中性糖侧链的空间位阻作用使蛋白液滴稳定.由此,笔者利用SSPS这一特性,使其与蛋白发生糖基化共价接枝,以使得到的共价接枝物在蛋白等电点区域 (pH4.5～5.0) 的各种物化性得到提升.这是因为葡聚糖分子糖链不带电荷，通过Maillard反应共价键接枝到蛋白分子表面的葡聚糖分子极其有限,大分子之间过低的接枝度使得葡聚糖对蛋白的物性修饰有很大的局限性,而SSPS属于阴离子多糖,其具有静电相互作用和空间位阻效应,两者在蛋白修饰中共同发挥作用,可以预期共价接枝物(SSC)将可能获得高的接枝度，并在酸性条件下同样具备优越的功能性.目前，SSPS与蛋白共价接枝产物及表征方面的研究在国内外鲜有报道.随着SSPS提取工艺的完善和其广泛应用,蛋白-可溶性大豆多糖糖基化产物将会受到更大的关注.因此， SSPS在蛋白物性修饰方面的应用是一个值得研究的方向.

本研究根据pH4.5和pH6.5下的溶解度将产物分离分级,通过对蛋白质-多糖共价接枝物(PPC)及其对照样间的物化性质的差异分析,探讨了大豆分离蛋白-大豆多糖糖基化产物具有优异功能特性的原因.

1 实验材料和方法

1.1 材料

低温脱脂豆粕购自山东嘉华保健品有限公司;可溶性大豆多糖B型(149～676 ku)购于福建泉州味博有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) 购于美国Sigma-Aldrich公司;其他生化试剂均为分析纯.实验用水为去离子水,电阻为15 MΩ.

1.2 实验仪器

Himac CR 22G型高速冷冻离心机、F- 7000型荧光分光光度计,日本Hitachi公司;Alpha- 4型冷冻干燥机,德国Christ公司;Rapid N型Dumas定氮仪 ,法国Elementar公司;DYCZ- 30型垂直板电泳仪,北京六一仪器厂;UV2300型紫外可见分光光度计，上海天美公司;Nano- ZS型激光动态粒度扫描仪,英国Malvern公司;MultiMode SPM型原子力显微镜,美国Veeco 公司.

1.3 实验方法

1.3.1 大豆分离蛋白的制备

大豆分离蛋白(SPI)根据文献[19- 20]的方法从低温脱脂豆粕中分离而得.杜马斯燃烧法测定其蛋白质含量为(83.621±0.352)% (蛋白质换算系数=5.71干基).

1.3.2 SSC的制备

根据前期的单因素试验中电泳结果[21],选择适宜的制备参数.将SPI与SSPS按1∶1的质量比混合后分散于磷酸盐缓冲溶液(10 mmol/L，pH=6.8) 中，使其质量浓度各达100 g/L.室温下搅拌2 h,冷冻干燥.干燥后的粉末过筛孔尺寸为0.125 mm的筛网.将冻干粉末放入底部装有饱和KBr溶液的干燥器中,置于60 ℃的烘箱中反应7 d.所得产物按一定的质量比(1∶10)加入去离子水,搅拌使其充分溶解.用1 mol/L的HCl调节pH值至4.5,搅拌2 h后于10 000g下离心30 min.得到的上清液回调pH值至6.5,冷冻干燥后得到组分SC45.沉淀以质量比1∶10复溶于去离子水中,回调pH值至6.5,10 000g下离心30 min,冷冻干燥后得到组分SC65,置于干燥器中保存备用.

采用Dumas法测得冻干的SC45和SC65样品中蛋白质含量分别为8.502%和26.195%.接枝物SC45和SC65各自所占比例为(57.3±3.0)%和(25.4±3.4)%.

1.3.3 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

依据Laemmli的方法进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[22].将样品置入样品缓冲液中(0.125 mol/L Tris-HCl缓冲液,含1%(质量分数)SDS、5%(体积分数)甘油、2%(体积分数)2-巯基乙醇(2-ME)和0.025%(质量分数)溴酚蓝),电泳前煮沸5 min,10 000g离心10 min,取上清液上样,上清液中蛋白质含量为2.0 mg/mL,上样量为5 μL.分离胶质量浓度为13%,浓缩胶质量浓度为5%.凝胶电泳于恒定电流下进行,样品在浓缩胶中的电流设定为20 mA,样品进入浓缩胶与分离胶界面后,将电流调节为40 mA,当电泳跑至距离电泳槽橡胶底边约1.5 cm时,关闭电源.分别用考马斯亮蓝R-250试剂和PAS染色法对凝胶胶片进行蛋白质及糖染色[23].脱色完成后,对胶片拍照并进行分析.

1.3.4 接枝度测定

采用三硝基苯磺酸(TNBS)法测定SSC的接枝度.将蛋白含量为1 mg/mL的0.5 mL待测样品、0.5 mL 4%的NaHCO3溶液、0.5 mL 10%的SDS溶液、0.5 mL 0.1%的TNBS溶液混合均匀,40 ℃中避光反应2 h后加入1 mol/L的HCl溶液0.25 mL和0.01 mol/L的HCl溶液2.25 mL,终止反应并于340 nm处测定其吸光度.

接枝度的计算公式为

1.3.5 巯基含量测定

根据Ellman法[24].将1 mL蛋白质量浓度为10 g/L的样品溶液添加到4 mL含1 mol/L尿素和0.01 mol/L乙二胺四乙酸 (EDTA) 的Tris-甘氨酸缓冲液 (0.1 mol/L，pH 8.0) 中.然后放入40 ℃水浴30 min,立即加入125 μL 2-硝基苯甲酸(DTNB)试剂 (20 mg DTNB溶于5 mL Tris-甘氨酸缓冲液中).在室温下放置10 min后,于412 nm处测定样液吸光值.总巯基含量的计算公式表示如下：

SH=73.53D412R/ρ.

式中:D412表示样品的吸光值;R表示稀释倍数,为5.125;ρ表示蛋白质量浓度,为10 mg/mL.

1.3.6 浊度测定

根据 Damodaran等[25]的方法.分别称取一定量的SPI、混合物和糖基化产物溶于不同pH值的水溶液中 (样品蛋白质量浓度为2 mg/mL),于540 nm处测定吸光值.

1.3.7 动态光散射测试

SPI、混合物和糖基化产物(蛋白质量浓度为1 mg/mL)的表观流体力学直径(dh)采用Zetasizer Nano-ZS仪器进行测量.样品溶解于5 mmol/L pH =7.0的磷酸缓冲液中,测量前不过滤,在25 ℃下测量3次取平均值.

样品的Zeta电位同样采用Zetasizer Nano-ZS仪器测量.激光器为4 mV的He-Ne激光器,入射波长为633 nm,于25 ℃下测量3次取平均值.

1.3.8 原子力显微镜测试

取2 μL样品溶液 (蛋白质量浓度为10 μg/mL) 分散于新鲜剥离的干净云母片上,室温下风干后使用MultiMode SPM 显微镜(Digital Instruments,Veeco,Santa Barbara,CA) 观察.样品溶液经0.22 μm滤膜过滤.测试用轻敲模式 (Tapping Mode) 成像.操作条件:扫描速度为1.0 Hz;频率为320 kHz;共振频率为290 kHz ;硅针尖的长度为125 μm,曲率半径为42 N/m (PointProbe NCHR，瑞士 NanoWorld 公司).使用 Digi-tal Nanoscope 软件 (version 5.30r3,Digital Instruments,Veeco) 对原子力显微镜(AFM)图片进行处理及分析.AFM图片中粒径分布曲线使用滤膜过滤后的样品测定.

2 实验结果与讨论

2.1 SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE鉴定SSC的形成,结果如图1所示.图1A部分中泳道2和图1B部分中泳道2都是典型的SPI特征条带.由蛋白染色中泳道4可见,带有负电荷的SSPS与SPI混合产物(SSM,未加热,下同)没有对SPI的特征条带产生影响,同时也说明没有经过干热反应的混合物不会生成共价接枝物.在图1A部分中，SC45和SC65两组分条带中7S(α′、α、β)和11S(AS、BS)球蛋白条带均变浅,7S球蛋白条带几乎消失.在图1B部分中,与SPI及SSM条带相比,泳道5、6的分离胶顶端及其与浓缩胶之间均有较大相对分子质量的物质产生,蛋白染色和糖染色结果均说明SPI与SSPS发生了共价交联,生成高相对分子质量的糖蛋白.由于接枝物的接枝度较高,为得到清晰的图谱，选取较少的上样量,取5 μL,故糖蛋白在上样液中含量较低，在糖染色中整体条带较浅.SPI经过加热处理(60 ℃、相对湿度为79%的条件下加热7 d)后,蛋白染色图谱(图1A部分泳道3)中7S球蛋白明显减少,并在图谱顶端形成分散性扫尾带,说明单纯的SPI干热条件下自聚集程度较高;但是,与7S球蛋白-葡聚糖糖基化产物和SPI-麦芽糊精糖基化产物相比[19，26],SSC的两个组分条带顶端均无扫尾带(图1A部分泳道5和6),说明相同反应条件下,SSPS能够有效减弱蛋白聚集.

与SC65组分相比,SC45组分蛋白染色条带(图1A部分中泳道5)稍浅,且在糖蛋白染色中分离胶顶端颜色较深,而SC65组分在图1B部分泳道6的下端形成较长分散性条带,这与糖基化产物接枝度的结果相同.

图1 蛋白质染色和糖染色的SDS-PAGE图谱

Fig.1 SDS-PAGE patterns with protein staining and carbohydrate staining

2.2 接枝度分析

蛋白质中游离氨基参与Maillard反应是对蛋白质侧链修饰的一种主要方法.本研究通过测定接枝度的变化来反映游离氨基的变化情况,进而表征Maillard反应的程度.

SC45和SC65两组分有很高的接枝度,分别为(41.79±0.62)%和(36.75±1.76)%.一般情况下,SPI与麦芽糊精的接枝度最高达26.46%,而7S球蛋白与葡聚糖接枝物可达28.61%[19].可能由于SSPS与蛋白带有相反电荷以及其侧链提供的空间位阻作用,SSC减少了SPI热聚集,使得SPI中更多游离的氨基酸基团连接到多糖分子的还原端.

2.3 巯基含量分析

为了探索不同pH条件下制备的糖基化产物对蛋白聚集行为的影响,对SSC及其对照样的总巯基含量进行了测定.尿素能破坏蛋白质分子中的氢键,导致蛋白质分子结构松弛,肽链伸展开来,从而使原来包藏在分子内部的巯基暴露.SPI的巯基含量为(6.78±0.38)μmol/g，加入SSPS后混合物的巯基含量较SPI有所增加,为(7.80±0.10)μmol/g.可能是由于SPI在溶液中伸展开来的肽链有一定程度的团聚,使巯基与DTNB反应减少,而SPI与SSPS在缓冲溶液中的静电相互作用减弱了SPI伸展开来的肽链的团聚.

SC45和SC65两组分巯基含量相差不大,分别为(16.96±0.76)μmol/g和(17.32±0.06)μmol/g,但比SPI和SSM的显著增加.结合之前接枝度和SDS-PAGE的结果可知,产生这种现象的原因可能是：在糖基化过程中,连接7S球蛋白和11S球蛋白亚基间的二硫键发生了断裂,生成了更多的巯基.与张曦等[26- 27]研究的7S球蛋白与葡聚糖糖基化产物的物化性质相比,SSC具有更高的巯基含量,说明SSPS对SPI具有独特的修饰作用.SC65的糖基化程度相对较低,生成的巯基暴露在蛋白分子表面,容易被检测;而SC45糖基化程度较高,蛋白分子表面链接的多糖数目较大,蛋白分子能被完整地包裹在多糖链中,可能干扰巯基的测定,使结果偏低.

SSPS和SPI发生共价结合反应的同时明显减弱了蛋白质因二硫键形成导致的聚集行为.另一方面,在食品加工过程中,蛋白表面巯基相对含量的变化是影响蛋白凝胶弹性和强度的重要因素.不断加热的条件下,分布于蛋白表面的巯基化学活性增强,分子之间发生巯基-二硫键相互转化,使得先前形成的网状结构由共价键进一步得到稳固,从而将溶液包含于凝胶内部.研究表明单纯的热制及冷制蛋白凝胶的网络结构较差[28- 30],且蛋白质过度的聚集不利于凝胶网络的有效形成.因此根据笔者的实验结果可以进一步推断,SC65的凝胶性能可能比SC45要好,这也给后续研究提供了指导方向.

2.4 浊度分析

图2示出了共价接枝物和SPI在不同pH条件下的浊度变化.浊度反映了溶液体系中不同悬浮颗粒的大小和数量,常被作为蛋白质聚集的指标.当蛋白质聚集至一定程度,溶液中颗粒直径变大,溶液浊度升高[31- 32].由图可知,SPI在其等电点pH4.5附近浊度最大,SSM浊度在SPI等电点附近显著降低,SSPS对蛋白聚集有良好的削减作用.这可能由于SSPS在酸性条件下具有较好的分散稳定性,它的空间位阻作用和静电相互作用使得混合物的浊度整体较低[19].

图 2 共价接枝物和对照样的浊度

与SPI相比,SC45和SC65在pH4.5附近的浊度均小于单纯蛋白质,但SC45和SC65两组分在酸性环境中浊度差异较大.SC65的浊度最高点前移,使得SPI的等电点向酸性方向偏移,并且在pH4.5附近溶解时,浊度显著高于SC45.这种现象的主要原因可能是蛋白-多糖的静电相互作用.在酸性条件下,SC45浊度最低,在不同pH条件下浊度几乎没有变化.SC45在pH4.5附近的溶解性能好,故浊度低,可能原因是接枝度较高,并且其中性侧链的空间位阻作用较强.但在中性环境中,SC45和SC65的浊度都略高于蛋白及其混合物,说明糖基化反应过程中生成了大分子共价复合物.

资料表明,糖基化有利于降低pH诱导的大豆分离蛋白的聚集行为[33].溶液体系 pH 的变化导致蛋白质分子电荷的变化,蛋白质在等电点时,以两性离子的形式存在,蛋白质分子总静电荷为零,蛋白质颗粒在溶液中没有电荷间的排斥作用,因而最不稳定,溶解度最小,蛋白质因疏水作用的驱动形成聚集体,因此SPI在等电点附近浊度最明显.当蛋白质肽链上共价接入糖链后,多羟基的亲水特性显著提高了蛋白质分子的溶解性能,并且多糖链引入的空间位阻效应也减弱了蛋白质分子由于静电吸引而聚集的能力[34].

2.5 粒径及Zeta电位分析

本研究结合动态光散射(DLS)与Zeta电位分析SSC在溶液中的稳定性.SPI、SSM、SC45和SC65的粒径分别为(69.56±3.17)、(77.43±0.21)、(241.05±4.22)、(78.81±0.71)nm,电位为(-37.1±1.51)、(-32.9±0.59)、(-14.7±0.62)、(-26.5±0.97)mV.与SPI相比,SPI在发生Maillard反应后生成的共价接枝物的Zeta电位绝对值均变小,这可能是因为共价接枝的SSPS主要覆盖在蛋白表面,一定程度上起到了屏蔽作用.结合DLS和接枝度分析可知,蛋白分子表面SSPS分子的覆盖率越大,屏蔽作用越明显,Zeta电位绝对值越小.在浊度测定的pH范围内,SC45浊度低,SC65浊度较高,而二者的电位绝对值结果与其相反,这说明糖基化产物体系的稳定性不是由电荷作用决定的,而是由接入的SSPS分子的亲水侧链及空间位阻作用决定的.

2.6 形貌学分析

本实验用AFM和DLS来研究糖基化对SPI聚集行为的影响.如图3(a)所示,SPI呈球状形态,样品分布相对均匀,大的颗粒可能是由于蛋白质轻度自身聚集所致.图3(b)为SSM的AFM照片,平均粒径比SPI稍大,聚集行为较为明显.在SC45的AFM图像中(见图3 (c) )存在大量大分子,蛋白表面被糖基化的多糖占据,并且在糖基化产物周围还存在一定量的游离多糖,这与SC45中蛋白含量和接枝度测定结果一致.DLS结果显示，SC45平均粒径为241.05 nm,并且粒子大小均一,溶液较为稳定,这与SSPS结构的亲水性质以及空间位阻作用密不可分.SC65中同样没有出现明显聚集现象,平均粒径较SC45小.

图3 SPI、SSM、SC45和SC65的AFM图像及粒径分布

Fig.3 AFM images and particle size distributions of SPI,SSM,SC45 and SC65

3 结论

本研究用干热法制备SSC,根据糖基化产物在 SPI 等电点附近和中性条件下的溶解性差异进行分离分级.通过 SDS-PAGE和AFM，从接枝度、巯基含量、浊度、动态光散射粒度和Zeta电位等方面探讨了糖基化产物物化性质的差异,得出以下结论:

(1)SSC的两种组分的接枝度分别为(41.79±0.62)%和(36.75±1.76)%,总巯基含量为(16.96±0.76)μmol/g和(17.32±0.06)μmol/g;

(2)接入的SSPS分子的亲水侧链及空间位阻作用决定了糖基化产物的稳定性;

(3)SSPS对蛋白的糖基化修饰能够有效抑制SPI分子间的热聚集.

[2] SUN Y,HAYAKAWA S,IZUMORI K.Modification of ovalbumin with a rare ketohexose through the Maillard reaction:effect on protein structure and gel properties [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(5):1293- 1299．

[3] WU N N,ZHANG J B,BIN T A N,et al.Characterization and interfacial behavior of nanoparticles prepared from amphiphilic hydrolysates ofβ-conglycinin-dextran conjugates [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(52):12678- 12685．

[4] AKHTAR M,DICKINSON E.Whey protein-maltodextrin conjugates as emulsifying agents:an alternative to gum ara-bic [J].Food Hydrocolloids,2007,21(4):607- 616.

[5] DIFTIS N,KIOSSEOGLOU V.Physicochemical properties of dry-heated soy protein isolate-dextran mixtures [J].Food Chemistry,2006,96(2):228- 233.

[6] KATO A,MINAKI K,KOBAYASHI K.Improvement of emulsifying properties of egg white proteins by the attachment of polysaccharide through Maillard reaction in a dry state [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1993,41(4):540- 543．

[7] KATO A,MURATA K,KOBAYASHI K.Preparation and characterization of ovalbumin-dextran conjugate having excellent emulsifying properties [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1988,36(3):31- 37．

[8] KATO Y，AOKI T，KATO N，et al．Modification of ovalbumin with glucose 6-phosphate by amino-carbonyl reaction:improvement of protein heat stability and emulsifying activity [J].Journal of Agricultural and Food Che-mistry，1995，43(2):301- 305．

[9] NAKAMURA S,KATO A,KOBAYASHI K.Enhanced antioxidative effect of ovalbumin due to covalent binding of polysaccharides [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1992,40(11):2033- 2037．

[10] EASA A M,HILL S E,MITCHELL J R,et al.Bovine serum albumin gelation as a result of the Maillard reaction [J].Food Hydrocolloids,1996,10(2):199- 202．

[11] MATSUDOMI N,NAKANO K,SOMA A,et al.Improvement of gel properties of dried egg white by modification with galacto-mannan through the Maillard reaction [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(14):4113- 4118．

[13] DIFTIS N,BILIADERIS C,KIOSSEOGLOU V.Rheological properties and stability of model salad dressing emulsions prepared with a dry-heated soybean protein isolate-dextran mixture [J].Food Hydrocolloids,2005,19(6):1025-1031.

[14] DIFTIS N,KIOSSEOGLOU V.Improvement of emulsi-fying properties of soybean protein isolate by conjugation with carboxymethyl cellulose [J].Food Chemistry,2003,81(1):1-6.

[15] DIFTIS,N,KIOSSEOGLOU V.Competitive adsorption between a dry-heated soy protein-dextran mixture and surface-active materials in oil-in-water emulsions [J].Food Hydrocolloids,2004,18(4):639- 646.

[16] MAEDA H.Soluble soybean polysaccharide [M].Osaka:Fuji Oil Co.Ltd.，1999:309- 319.

[17] CHEN S C.Proceedings of Kellogg international symposium on dietary fiber [R].Tokyo:Center for Academic Publications Japan,1990.

[18] KIKUCHI T,YOKOTSUKA T.Studies on the polysaccharides from soy scauce partI.purification and properties of two acidic polysaccharides [J].Agricultural and Biological Chemistry，1972,36(4):544- 550.

[19] 张晋博.多糖对大豆蛋白的修饰及其界面、乳化和凝 胶性质的研究[D].广州： 华南理工大学,2013.

[20] WANG X S,Tang C H,Li B S,et al.Effect of high-pressure treatment on some physicochemical and functional properties of soy protein isolates [J].Food Hydrocolloids,2008,22(4):560- 567.

[21] 齐军茹,曹静.一种基于可溶性大豆多糖的糖基化蛋白及其制备方法:CN105669825A [P].2016- 02- 18.

[22] LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 [J].Nature,1970,227(5259):680- 685.

[23] CERRI P S,CERRI E S.Staining methods applied to glycol methacrylate embedded tissue sections [J].Micron,2003,34(8):365- 372.

[24] BEVERIDGE T,TOMA S J,NAKAI S.Determination of -SH and -SS- groups in some food proteins using Ellman’s reagent [J].Journal of Food Science,1974,39(1):49- 56.

[25] DAMODARAN S,KINSELLA J E.Effect of conglycinin on the thermal aggregation of glycinin [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1982,30(5):812- 817.

[26] ZHANG X,QI J R,LI K K,et al.Characterization of soyβ-conglycinin-dextran conjugate prepared by Maillard reaction in crowded liquid system [J].Food Research International,2012,49(2):648- 654．

[27] 张曦.大分子拥挤环境下葡聚糖对大豆7S球蛋白的物性修饰研究 [D].广州：华南理工大学,2013.

[28] MARIA Cecilia Puppo,MARIA Cristina Anon.Structural properties of heat-induced soy protein gels as affected by ionic strength and pH [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998,46(9):3583- 3589.

[29] ANNE Maiiais,GABRIEL E Remondetto,Rolando Gonzalez,et al.Formation of soy protein isolate cold-set gels:protein and salt effects [J].Journal of Food Science,2005,70(1):C67- C73.

[30] 沈钟,王果庭.胶体与表面化学 [M].北京：化学工业出版社,2002.

[31] 许彩虹.大豆球蛋白糖基化接枝改性及其热聚集行为研究 [D].广州：华南理工大学,2010.

[32] THORARINSDOTTIR K A,ARASON S,GEIRSDOTTIR M B,et al.Changes in myofibrillar proteins dsuring processing of salted cod (Gadusmorhua) as determined by eelectrophoresis and differential scanning calorimetry [J].Food Chemistry,2002,77(3):377- 385.

[33] 聂剑初,吴国利,张翼伸，等.生物化学简明教程 [M].北京：高等教育出版社,1995.

[34] 张曦,齐军茹,杨晓泉.大分子拥挤环境下大豆7S球蛋白糖基化研究 [J].食品工业科技,2012,33(15):58- 61.