三种不同产地蒙药草乌炮制前后三种乌头碱含量的比较研究

●金宝

三种不同产地蒙药草乌炮制前后三种乌头碱含量的比较研究

●金宝

目的：测定三种不同产地的生草乌和制草乌中的有效成分含量，检定药材质量，对炮制前后的双酯型生物碱含量变化进行测定。方法：使用HPLC方法进行测定，选择四川、吉林与新疆三地的草包进行测定。色谱柱：Agilent SB-C18，尺寸4.6mm×250mm，粒径5μm；流动相：甲醇0.3mol·L-1三乙胺（65：35）；流速：1.0mol·min-1；柱温：35℃；检测波长：235nm，梯度洗脱。结果：草乌在炮制前后的双酯型生物碱含量会有一定变化，呈降低趋势，四川、新疆、吉林各产地的变化趋势分别为：0.4405降低到0.1553，6.0910降低到2.3257，1.2328降低到1.0073。结论：产地不同，双酯型生物碱含量差异也比较明显，在入药前要先测定含量，经炮制后，再入药，以确保用药安全。

草乌；炮制；双酯型生物碱；含量

草乌是毛莨科乌头属植物北乌头Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥块根，作为一种中药材，可以袪风除湿，止痛温经，其活性成分主要是生物碱，所含双酯型生物碱含有剧毒，温热条件下，性质不稳定，可能会分解为低毒性的单酯生物碱，因此，草乌一般要经过炮制降低毒性后，才能入药。为了确保用药安全，使用草乌时需要测定其制品或者制剂中的双酯型乌头碱含量。

1 仪器与试剂

（1）仪器。高效液相色谱仪（Agilent 1100)，美国Agilent公司；电子天平(CPA225D），德国赛多利斯公司；旋转蒸发仪（BUCHI B49），瑞士Buchi公司；超声清洗仪，江苏昆山市超声仪器有限公司；恒温水浴锅（W2-100SP），上海申生。

（2）试剂。乌头碱对照品（MUST-15013008)，新乌头碱对照品（MUST-14100909)，次乌头碱对照品（MUST-14100908)，均为成都曼思特生物科技公司生产，纯度均不低于98.0%；诃子，生草乌，济南仁和；甲醇，色谱纯，Thermo Fisher Scientific Inc.；三乙胺与其他试剂为分析纯；草乌从四川、吉林和新疆采集，由松林教授鉴定为毛莨科植物北乌头的干燥块根。

2 方法与结果

（1）色谱条件。色谱柱∶Agilent SB-C18，尺寸4.6mm×250mm，粒 径 5μm； 流 动 相∶ 甲 醇 0.3mol·L-1三 乙 胺（65∶35）， 梯 度洗 脱∶0min-16min(5%-20%)，16min-45min(20%-30%)，45min-60min(30%-35%)，60min-70min(40%)； 流 速∶1.0mol·min-1； 柱 温∶35℃；检测波长∶235nm。

（2）制备对照品溶液。精密称取乌头碱对照品0.85mg、新乌头碱对照品1.52mg、次乌头碱对照品1.59mg，在5mL量瓶中放置，加入0.05%甲醇溶液，溶解并稀释到刻度，摇匀后再使用0.45μm粒径的滤膜过滤后即可获得。

（3）制备炮制品。诃子3kg加入30L水蒸制，加入10kg的草乌，再浸泡2-3d后，口尝时轻微麻舌即为适度，取出炮制品，干燥即可。

（4）制备供试品溶液

精密称取生草乌与炮制草乌粉末（过4号筛）各2g，置具塞入锥形瓶中，加入3ml氨试液，湿润20min。精密加入异丙醇∶乙酸乙酯混合溶液（1∶1）50ml，摇匀后称重，用超声30min后冷却，再称重，加入异丙醇和乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足失去的重量，摇匀后，用0.45μm粒径的滤膜过滤，取出续滤液后即可。

（5）线性关系。精密吸取制备的混合对照品溶液2、4、6、9、10，置入100ml瓶中，加入0.05%甲醇溶液以便定容，摇匀后，就能得到6种浓度不同的对照品溶液。注入液相色谱仪后，取峰面积当作纵坐标，取进样量当作横坐标，制作标准曲线，并得到相应的回归方程，分别为∶乌头碱回归方程Y=942580X+28350，r=0.9997；次乌头碱回归方程Y=797130X+86810，r=0.9996；新乌头碱回归方程Y=540560X+97040，r=0.9998；计算可知，0.34μL-1.70μL线性范围内的乌头碱、0.64μL-3.18μL线性范围内的次乌头碱、0.61μL-3.04μL线性范围内的新乌头碱，处于线性关系良好的状态下。

（6）精密度试验。将第2项下制备的溶液稀释100倍后，分别量取0.85、1.60、1、50mg/mL的乌头碱、次乌头碱以及新乌头碱对照品溶液10μL进样，做5次连续进样，再测定这三种生物碱峰面积，计算RSD后，可知新乌头碱、乌头碱与次乌头碱在0.48%、0.43%、0.33%的RSD下能够保持良好的精密度。

（7）重复性试验。精密称取同一项草乌3份，按照第4项的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照第1项的色谱条件完成进样测定后，可以从结果样品中分析新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的RSD平均为0.47%、0.52%、0.87%（n=3），根据特征色谱所测定的方法有良好的重复性。

（8）稳定性试验。称取同一个供试品溶液，在0、2、6、12、24h时分别进样1次，并记录3种生物碱的峰面积，新乌头原碱、次乌头原碱、乌头碱的RSD分别在0.68%、0.47%和0.45%，这些溶液能够在24h维持基本的稳定状态。

（9）加样回收率试验。取已知的3种生物碱含量相同的草乌5份，每份中分别加入适量的3种生物碱对照品，根据第4项中的方法制备供试品溶液，测定回收率后，可知乌头碱、次乌头碱与新乌头碱回收率平均值分别为98.72%、98.27%和97.35%，RSD平均值分别为2.25、1.26、1.13。

（10）样品测定。测定3产地样品中的3种生物碱含量，结果为∶四川产草乌新乌头碱、次乌头碱、乌头碱含量分别为0.0302、0.004、0.4099，双酯型生物碱总含量为0.4405；吉林产草乌新乌头碱、次乌头碱、乌头碱含量分别为0.9257、0.2272、0.0799，双酯型生物碱总含量为1.2328；新疆产草乌新乌头碱、次乌头碱、乌头碱含量分别为2.8653、0、3.2257，双酯型生物碱总含量为6.0910。生草乌中的双酯型生物碱总含量在0.4405-6.0910mgg-1，乌头碱含量最高，也最为普遍。

（11）炮制后三产地生物碱含量。测定草乌中3种生物碱炮制后的含量变化，结果为∶四川产草乌新乌头碱、次乌头碱、乌头碱含量分别为0.0075、0.0003、0.1475，双酯型生物碱总含量为0.1553；吉林产草乌新乌头碱、次乌头碱、乌头碱含量分别为0.7581、0.1909、0.0583，双酯型生物碱总含量为1.0073；新疆产草乌新乌头碱、次乌头碱、乌头碱含量分别为0.0984、0、2.2273，双酯型生物碱总含量为2.3257。炮制后的三产地生物含量依然是新疆产最多，其次为吉林产，最后为四川产。

3 讨论

草乌中的生物碱成分含量较大，其中双酯型乌头碱含量在不同产地间差异较大，新疆产草乌的双酯型生物碱总含量远高于其他两地，四川产草乌则含有最少的双酯型生物碱，吉林产草乌双酯型生物碱含量也很全面。草乌的成分测定，对于安全用药有重要意义，毒性成分含量过高，则需要更加严格的炮制过程，最大限度保持安全用药。如果毒性成分过低，为保留有效成分，则需要适度炮制。加入诃子炮制草乌后，能够使部分毒性成分降低。诃子中的鞣质成分能够促进生物碱的溶出，将诃子和草乌共煎后，更容易溶出双酯型生物碱，降低毒性，同时还能更好地保留药效。

（作者单位：内蒙古阿拉善左旗吉兰太卫生院）

[1]萨仁高娃,陈红梅.蒙药制草乌的炮制时间对总乌头碱含量的影响与中药制草乌的总乌头碱含量比较[C]// 中国药学大会暨中国药师周大会.2010:1078-1081

[2]赵爱娟,李红,图雅,李霄.诃子与草乌不同比例配伍对3种双酯型生物碱含量的影响[J].长春中医药大学学报,2016,32(4):697-700