补肾活血方对老年大鼠心脏自由基代谢及p16蛋白表达的影响

陈靓++崔开宇++吴勇++杨伟峰

摘要：目的 观察补肾活血方对老年大鼠心脏自由基代谢和p16蛋白表达的影响，探讨其对衰老大鼠心脏的保护作用机制。方法 100只大鼠随机分为青年对照组、老年对照组和补肾活血方高、中、低剂量组，每组20只。各给药组给予相应药物灌胃，每日1次，连续16周。末次给药后1 h，将大鼠麻醉后取血清和心脏。测定血清和心肌组织一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量和过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性；免疫组化检测心肌组织β-半乳糖苷酶和p16蛋白表达。结果 与老年对照组比较，补肾活血方高剂量组大鼠血清NO含量和CAT、SOD活性显著升高（P<0.05），补肾活血方各剂量组MDA含量显著降低（P<0.01）；补肾活血方高剂量组大鼠心肌组织NO含量和SOD活性显著升高，MDA含量显著降低（P<0.05），补肾活血方各剂量组CAT活性显著升高（P<0.05，P<0.01）；补肾活血方各剂量组心肌组织β-半乳糖苷酶和p16蛋白表达降低。结论 补肾活血方通过抗氧化损伤和抑制抑癌基因p16表达，发挥抑制老年大鼠心肌老化的作用。

关键词：补肾活血方；衰老大鼠；氧化损伤；p16蛋白表达

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.01.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）01-0055-04

Effects of Bushen Huoxue Formula on Free Radical Metabolism and p16 Protein Expression in Heart of Aged Rats CHEN Liang1， CUI Kai-yu1， WU Yong1， YANG Wei-feng2 （1. Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan 430065， China； 2. Experimental Research Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Bushen Huoxue Formula on free radical metabolism and p16 protein expression in heart of aged rats； To discuss its protective mechanism to the heart of aged rats. Methods One hundred were divided into young control group， the natural aging group， Bushen Huoxue Formula high-， medium- and low-dose groups， with 20 rats in each group. Each medication group was given relevant medicine for gavage， once a day for 16 weeks. 1 hour after the last administration， after the rats were sacrificed， serum and heart were taken. The contents of NO and MDA and activities of CAT and SOD in serum and myocardial， β-galactosidase enzyme and p16 protein expression in myocardial tissue were detected. Results Compared with the natural aging group， NO content and SOD activity in the serum of rats in Bushen Huoxue Formula high-dose group increased significantly （P<0.05） and MDA content in all Bushen Huoxue Formula groups decreased （P<0.01）； NO content， CAT and SOD activity in the myocardial tissue of rats in Bushen Huoxue Formula high-dose group increased significantly， and MDA content decreased significantly （P<0.05）. CAT activity in all Bushen Huoxue Formula groups increased （P<0.05， P<0.01）. β-galactosidase enzyme and p16 protein expression in myocardial tissue in all Bushen Huoxue Formula groups decreased. Conclusion Bushen Huoxue Formula can in hibit the aging of myocardial-aged rats， and the mechanism might be related to its anti-oxidative damage and inhibition of tumor suppressor gene p16 expression.endprint

Key words： Bushen Huoxue Formula； aging rats； oxidative stress； p16 protein expression

中医对衰老机理的认识和研究源远流长，传统理

基金项目：湖北省自然科学基金（2012FKB02102）

通讯作者：杨伟峰，E-mail：sunzhuyang@126.com

论强调肾虚是衰老的主要原因。近年来，血瘀致衰逐渐受到重视，提出肾虚血瘀是衰老的基本病机之一，补肾活血亦成为延缓衰老的一项基本治则[1-2]。目前，国内外学者对衰老过程中心脏发生的病理性改变已基本达成共识，随着年龄的增长，心脏形态结构及功能逐渐发生变化，主要病理特征为心肌细胞坏死凋亡、心肌细胞肥大及心肌纤维化等改变，心肌纤维化是心脏老化的一个重要特征[3]。本课题组前期研究发现，补肾活血方能有效缓解心肌梗死后心肌纤维化程度[4]。本研究观察补肾活血方对自然衰老大鼠心脏氧化损伤相关指标及细胞周期相关的p16蛋白表达的影响，探讨其对衰老大鼠心脏的保护作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

3月龄和20月龄SPF级Wistar大鼠各50只，雌雄各半，北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号SCXC（京）2009-0004。饲养于中国中医科学院西苑医院动物实验中心，普通饲料喂养，每笼5只，温度20～25 ℃，12 h光照交替，自由饮水摄食，分笼饲养。

1.2 药物

淫羊藿、丹参饮片，购自北京神农饮片有限责任公司，黄山药饮片，购自云南玉龙中药材公司，经中国中医科学院何希荣教授鉴定符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。使用前除去杂质，干燥，备用。补肾活血方（淫羊藿、丹参、黄山药）由中国中医科学院西苑医院实验中心提取并制备为含原药材1 g/mL浸膏。

1.3 主要试剂与仪器

超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、一氧化氮（NO）测试盒，南京建成生物工程研究所。β-半乳糖苷酶一抗、多克隆兔抗大鼠p16抗体，北京博奥森生物技术有限公司；SABC免疫组化试剂盒、抗体稀释液、DAB显色试剂盒，武汉博士德生物技术公司。iMARK酶标仪（美国Bio-bad公司），AE240电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司），RM2235组织切片机、HI1220烤片机、ST5020全自动组织脱水机（德国Leica）；bx51显微镜（日本Olympus），Anymicro DSSTM图像采集系统（北京裕天世纪伟业科技发展有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组和给药

大鼠适应性喂养3 d后，随机分为青年对照组、老年对照组和补肾活血方高、中、低剂量组（10.0、5.0、2.5 g原药材/kg），每组10只。各给药组给予相应剂量药物灌胃，青年对照组和老年对照组给予等量生理盐水灌胃。给药体积为10 mL/kg，每日1次，连续16周。末次给药后1 h，大鼠麻醉后腹主动脉采血，3000 r/min离心15 min，收集血清，-20 ℃保存备用；开胸摘取心脏，生理盐水冲洗，留取部分心脏组织10%中性福尔马林固定、保存，其余组织-80 ℃冻存。

2.2 一般状况观察

给药期间每日观察大鼠精神状态、皮毛、饮食、活动、体质量、大小便、对外界刺激的反应等变化。

2.3 血清超氧化物歧化酶、丙二醛、过氧化氢酶、一氧化氮检测

取备用血清，测定血清SOD、MDA、CAT、NO含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.4 心肌组织超氧化物歧化酶、丙二醛、过氧化氢酶、一氧化氮检测

心肌组织称重，加入一定比例PBS，组织匀浆，3000 r/min离心15 min，取组织匀浆液，测定心肌组织SOD、CAT活性和MDA、NO含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.5 病理组织学检查

10%中性福尔马林固定心肌组织，常规石蜡切片（厚度6 mm），HE染色，中性树胶封片，镜下观察拍照。

2.6 免疫组化检测心肌组织β-半乳糖苷酶和p16的蛋白表达

所有切片进行常规二甲苯脱蜡，免疫组化染色检测心肌衰老特异性β-半乳糖苷酶及细胞周期蛋白p16的蛋白表达。脱蜡、水化组织切片，经枸橼酸盐微波抗原修复（温度95 ℃，5 min×3次），自然冷却，滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶。分别滴加β-半乳糖苷酶、p16抗体（抗体效价1∶200），4 ℃冰箱过夜。滴加生物素化二抗，室温孵育15～20 min，镜下DAB显色，苏木素复染。常规脱水、透明、封片，显微镜观察。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般状况

与青年对照组比较，老年对照组大鼠出现倦卧、嗜睡懒动、毛色发黄无光、精神不振等。给予补肾活血方后，老年大鼠外观表现有所改善。

4.2 补肾活血方对衰老大鼠血清丙二醛、一氧化氮含量和过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性的影响

与青年对照组比较，老年对照组大鼠血清NO含量和CAT、SOD活性显著降低（P<0.01），MDA含量显著升高（P<0.01）；与老年对照组比较，补肾活血方高剂量组大鼠血清NO含量和CAT、SOD活性显著升高（P<0.05），补肾活血方各剂量组MDA含量显著降低（P<0.01），且呈一定的量-效关系。结果见表1。

4.3 补肾活血方对衰老大鼠心肌组织丙二醛、一氧化氮含量和过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性的影响endprint

与青年对照组比较，老年对照组大鼠心肌组织NO含量和CAT、SOD活性显著降低（P<0.05，P<0.01），MDA含量显著升高（P<0.05）；与老年对照组比较，补肾活血方高剂量组大鼠心肌组织NO含量和SOD活性显著升高，MDA含量显著降低（P<0.05），补肾活血方各剂量组CAT活性显著升高（P<0.05，P<0.01），且呈一定的量-效关系。结果见表2。

4.4 病理观察结果

青年对照组大鼠心肌细胞排列致密，细胞间质较少；老年对照组大鼠心肌细胞数量有所减少，细胞略肥大，排列不整齐，细胞间质增多；补肾活血方各剂量组大鼠心肌细胞肥大有所改善，细胞间质相应减少。结果见图1。

4.5 补肾活血方对衰老大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶和p16蛋白表达的影响

β-半乳糖苷酶和p16表达阳性细胞为细胞浆染色呈棕黄色。青年对照组大鼠心肌组织中偶见棕黄色细胞；老年对照组大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶和p16表达阳性细胞显著增多；补肾活血方各剂量组大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶和p16表达阳性数量有所降低，且呈一定的量-效关系。结果见图2、图3。

5 讨论

在老年医学研究领域中，老化动物模型的应用十分多见，其中自然衰老动物模型和D-半乳糖致衰老动物模型应用较为广泛[5]。自然衰老动物模型是在正常生活条件下，通过较长时间的饲养，让动物正常地进行生理发育直到老化的模型。该模型能较好地反映机体衰老的病理生理状态。因此，相比于药物或放射等人为干预致衰老的动物模型而言，自然衰老动物模型能较好吻合机体衰老的真实过程，最适宜用于衰老机理及延缓衰老药物的研究[6]。本研究综合多因素考虑，为较好反映中药抗衰老作用及后续的机制研究，选择自然衰老动物模型作为研究对象。β-半乳糖苷酶是老化细胞在体外识别的一个重要标志，本研究也显示老年大鼠心肌细胞β-半乳糖苷酶明显增高，而补肾活血方可以明显降低其含量，表明补肾活血方对衰老心肌具有保护作用。

现代研究认为，细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用是造成衰老过程中退行性变化的原因，机体的衰老过程与氧化应激密切相关[7]。其中体内参与抗氧化反应的酶类主要包括SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，其活性反映机体清除自由基的能力。CAT则是清除H2O2的主要酶，也是体内所有酶中转换率最高的酶。GSH-Px则可与SOD发挥协同作用，防止脂质过氧化及其代谢产物对机体的损害。GSH-Px和SOD活性随机体的衰老而逐渐降低，体内自由基增多，自由基作用于生物膜脂质双分子层中的不饱和脂肪酸，可引起脂质过氧化，形成MDA等脂质过氧化产物。测定MDA水平能较好地反映脂质过氧化水平，可以作为评价衰老的指标之一[8]。本实验结果表明，补肾活血方可升高老年大鼠血清和心肌组织CAT、SOD活性，降低MDA水平，尤以高剂量组作用显著，且呈一定的量-效关系，显示出明显的抗氧化损伤作用，对衰老大鼠心肌细胞具有保护作用。

抑癌基因p16在衰老细胞中起重要的作用，p16基因与个体发育、分化、生长、衰老密切相关[9]，它在复制衰老时多呈高表达。研究发现，细胞衰老时，p16基因的mRNA转录及蛋白表达水平升高，抑制细胞有丝分裂，刺激发生反应而产生RB蛋白的磷酸化，从而维持了衰老细胞不可逆的生长停滞状态[10-11]。本实验结果显示，补肾活血方对老年大鼠心肌组织p16的蛋白表达有明显抑制作用，这种作用可抑制心肌衰老，对心肌具有保护作用。

综上，补肾活血方对老年大鼠心肌有保护作用，其机制与其抗氧化损伤和抑制抑癌基因p16的表达有关。

参考文献：

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（收稿日期：2016-03-09）

（修回日期：2016-03-29；编辑：华强）endprint