MALDI-TOF MS在病原性丝状真菌鉴定中的应用进展

李颖 徐英春

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院检验科 侵袭性真菌病精准诊断与机制研究北京市重点实验室，北京 100730)

近年来，随着恶性肿瘤、艾滋病等免疫系统损伤性疾病的发病率不断攀升，临床上罹患真菌感染的病例也在逐年增多，且近十余年的流行病学研究显示，曲霉、镰刀菌、接合菌等丝状真菌引起的深部感染越来越多，在某些特定人群中其感染率甚至超过酵母菌[1-3]。丝状真菌种类繁多，分类复杂，耐药谱多变，不同种属菌株对常用一线抗真菌药物的反映效果不同[4-6]，所以，对丝状真菌进行准确种属鉴定可以更有针对性地指导临床选择和使用抗真菌药物，减少无效或错误用药情况的发生。

目前大多数微生物实验室仍主要依靠传统形态学方法鉴定丝状真菌，但该方法存在着耗时长、准确率低的局限性，且需要检验人员具有较高的专业知识水平及丰富的真菌鉴定经验。基因序列分析技术在微生物菌种鉴定方面具有较高的准确性，但成本高、对操作人员及操作环境要求高等缺点一定程度上限制了其在微生物实验室的应用[7]。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS)是近些年兴起的微生物快速鉴定分析技术，已被成功应用于细菌及酵母样真菌的菌种鉴定且成效显著；而在丝状真菌鉴定方面，其鉴定效能及应用程度略逊，仍处于探索与完善阶段[8-10]。本文对近年国际上有关MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌方面的研究做一综述，旨在为微生物实验室工作人员提供相应的研究信息。

1 背景简介

目前国际上使用较为广泛的MALDI-TOF MS系统主要有德国布鲁克 (Bruker Daltonics)公司生产的Microflex LT MS和Autoflex LT MS系统以及法国梅里埃 (bio Mérieux)公司的Vitek MS系统。其中Bruker MS在主数据库的基础上还配有独立的丝状真菌数据库，内中包含126种丝状真菌参考质谱峰图；Vitek MS数据库现已更新到3.0版本，内有多种细菌和真菌参考质谱峰图。上述MS系统均已通过美国食品药品管理委员会 (FDA)认证，但仅限于细菌和酵母菌鉴定[11]。致使MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌呈滞后局面的原因主要包括以下两点：①丝状真菌本身的特性，如细胞壁厚且坚韧、破壁困难，而质谱技术分析的主要是胞内核糖体蛋白成分，故不易获得高质量MS图谱；同时具有菌丝和孢子两种细胞成分，且文献报道两种细胞成分在质谱峰图上存在差异[12]；同时具有有性期和无性期两种生长阶段，等等。②数据库的局限性，现有的丝状真菌质谱鉴定商业数据库菌种涵盖范围有限，尚无法满足临床丝状真菌分离株的鉴定需求；且由于不同地区丝状真菌的优势流行菌种多有不同，致使同一数据库在不同实验室及不同地区间的鉴定效能存在差异。为此，国际上相继开展了大量相关研究拟解决这一难题，并取得了实质性的进展。

2 丝状真菌质谱分析前处理

丝状真菌细胞壁含有较多的几丁质成分，壁厚且坚韧，需对其进行前处理使细胞壁充分破裂，胞内核糖体蛋白释放溶出方可用于后续MS分析。最常用的前处理方法是甲酸-乙腈提取法，其中甲酸溶液起破坏细胞壁的作用，乙腈则有助于胞内核糖体蛋白的进一步释出。该方法也是Bruker 和Vitek MS系统推荐的丝状真菌MS分析前处理流程。在此基础上有研究拟对破壁环节进行优化，包括磁珠震荡破壁、预加热等[13]。其中磁珠震荡辅助破壁法一定程度上有助于获取高质量质谱峰图，但相应地使得丝状真菌前处理流程更为繁琐，故其应用价值还有待进一步评估。

3 MALDI-TOF MS在病原性丝状真菌鉴定中的应用

3.1 曲霉

曲霉是临床分离率最高的丝状真菌，尽管其有着典型的镜下结构，但不同种间形态差异不明显，尤其是经药物治疗后的曲霉分离株形态易发生变化，致使单纯形态学方法往往不能有效解决曲霉菌种鉴定的难题。相应地，国际上针对MALDI-TOF MS鉴定曲霉的研究也较多。

虽然Bruker和Vitek MS数据库中均包含多种曲霉的参考谱图，但由于不同系统在操作流程上存在差异以及部分曲霉少见种在数据库中无对应参考谱图等因素致使上述两个商业数据库在曲霉鉴定方面并未得到充分应用[14-16]。尤其是Bruker MS采用液体培养菌株进行建库，并推荐对待分析丝状真菌进行液体培养富集菌丝体后再进行MS鉴定，而曲霉液体培养罕被用于真菌实验室，故大多数研究仍倾向于建立本实验室的曲霉MS数据库，一方面在操作流程上可以与常规曲霉鉴定工作进行更好地衔接，还可以通过不断更新数据库内的参考谱图逐渐提高该自建数据库的鉴定能力。自2013年NIH机构建立了第一个大规模丝状真菌数据库以来，陆续有多地区多机构相继建立本地大规模曲霉等丝状真菌质谱鉴定数据库，并取得了较高的鉴定准确率 (>90%)[14，17-18]。尽管自建库是提升质谱鉴定曲霉准确性的重要手段之一，但对于一些保藏菌种缺乏多样性的中层机构，可选择仅对独特菌种进行建库，将其与商业数据库进行整合使用，如澳大利亚Sleiman等在Bruker MS丝状真菌数据库的基础上添加了实验室自建的18种曲霉参考谱图，可将曲霉种水平鉴定率从69%提升至93%[19]。另外，随着商业数据库的不断更新与完善，McMullen AR等研究人员采用Vitek MS最新版本数据库 (v3.0，2016年底发布)对144株曲霉进行菌种鉴定，其中93.6% (133/144)被准确鉴定到种水平，对经形态学方法仅鉴定到属水平的13株曲霉亦可实现种水平鉴定[20]。

3.2 镰刀菌

镰刀菌可引起人类眼内炎、角膜炎、脓皮病等，还可经血行播散至身体其他部位引起全身感染；且镰刀菌对大多数常用抗真菌药物如唑类和棘白菌素均具有耐药性[21]，故对分离镰刀菌进行及时种属水平鉴定有助于指导临床正确选择治疗药物。镰刀菌分类复杂，形态学和基因测序鉴定技术均不易实现种水平鉴定[22]。国际上关于镰刀菌质谱鉴定的研究多集中在本地数据库的建立且效果明显[23-25]。Triest等人对分属于40个不同种的289株镰刀菌进行Bruker自建库MS分析，该自建库能够将全部受试镰刀菌准确鉴定至复合群水平，进一步地，82.8% (239/289)菌株在种水平鉴定正确 (鉴定分值>2.0)。对受试镰刀菌进行抗真菌药敏实验揭示不同镰刀菌复合群间的抗药谱存在较大差异，但同一复合群内的不同种间抗药谱多相同或相近。据此，研究人员提出以鉴定至复合群水平作为MALDI-TOF MS鉴定镰刀菌的新标准[26]。这一提案有助于提升MALDI-TOF MS在镰刀菌鉴定方面的有效性及临床实用性。

3.3 接合菌

临床上常见的接合菌主要包括毛霉、根霉、根毛霉以及共头霉；横梗霉 (原名犁头霉)在欧洲国家有着较高的感染率，但在我国其分离率不高。目前国际上有关MALDI-TOF MS鉴定接合菌的研究几乎均涉及自建库的应用，包括建立独立的接合菌本地质谱鉴定数据库或将自建库与商业数据库联合使用，能够显著提高MALDI-TOF MS鉴定接合菌的准确率[18，27]。Dolatabadi等[28]学者采用MALDI-TOF MS对25株小孢根霉和13株少根根霉及其变种进行区分，并根据质谱峰图构建系统发生树，发现该树状图与经基因分型方法得到的树状图分布一致，且少根根霉的两个变种在MS树状图中也能区分开来，表明MALDI-TOF MS不仅在微生物菌种鉴定方面具有优势，在变种区分及菌群进化关系研究中亦存在潜质。

3.4 皮肤癣菌

鉴于现有MS商业数据库中皮肤癣菌的菌种涵盖范围有限，目前国际上关于MALDI-TOF MS鉴定皮肤癣菌的研究多基于用户自建库的应用，并取得了较好的鉴定效果。Calderaro等[29]研究人员对24株经分子测序明确种属信息的皮肤癣菌进行建库来填补商业数据库的菌种数不足，并用64株皮肤癣菌临床分离株进行评估，其中大多数原始数据库中不存在对应种属参考谱图的菌株在综合库中均得到了准确鉴定。De Respinis等[30]在Vitek MS数据库(V2.0.0)的基础上，将包含17种皮肤癣菌参考谱图的自建库与之联用，并对分属于13个种属的131株表皮癣菌临床分离株进行鉴定评估，其中10个分类群的菌株鉴定准确率可达100%。

3.5 其他病原性丝状真菌

马内菲蓝状菌是临床重要的双向性致病真菌，在我国主要分离自华南地区。由于Bruker MS数据库中不包含马内菲蓝状菌的参考谱图，台湾Chen等研究人员对收集的28株马内菲蓝状菌进行主成分聚类分析，得到4个簇；从每个簇中挑取1株菌按照标准流程进行自建库。该自建库能够对28株马内菲蓝状菌进行准确鉴定，其中仅1株菌鉴定分值较低[31]。Sleiman等[19]研究人员通过将Bruker MS丝状真菌数据库与实验室自行建立的包含4种赛多孢霉参考谱图数据库联用，可将赛多孢霉种水平鉴定率从18%提升至94%。Ranque等[18]通过Bruker MS自建库对157株非曲霉丝状真菌进行种属鉴定，MS对非曲霉丝状真菌的鉴定准确率显著高于形态学方法 (61.2% vs 30.6%)，主要由于某些非曲霉丝状真菌的镜下结构较单一，缺乏特征性结构，故传统形态学鉴定多无效，而MALDI-TOF MS能够有效地弥补这一不足。

4 展 望

尽管现阶段MALDI-TOF MS在丝状真菌鉴定领域仍然处于探索阶段，但是，通过不断更新与扩充数据库内参考菌种数量以及优化MS分析前处理等手段能够显著提高MALDI-TOF MS在丝状真菌鉴定方面的效能，相信MALDI-TOF MS有能力成为快速、准确、有效的病原性丝状真菌鉴定手段。

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