孢子丝菌相关复合种需加强生物安全检控

黄梦雅 周汛

(重庆市中医院皮肤美容科，重庆 400021)

自然界真菌的物种数总数远远超过植物和脊椎动物物种数的总和，较为保守的估计有150万种。作为真核生物内的单系群，已合格发表的真菌总数约达1.8万属、12万种[1]。这其中仅少数对人体有害，主要引起人体的浅表皮肤或深部真菌感染。作为我国的对内对外门户，国家进出口检疫部门对包括真菌在内的各个物种进行紧密、准确的监测，建立一个完善的真菌检测系统对生态安全和国民健康至关重要。

1 真菌命名及分类的历史与发展

真菌病原学的研究历史悠久。发现、更新以及特异性鉴定与研究真菌新菌种为真菌感染性疾病制定防范方案、早期诊断以及研发特异性抗真菌药物发挥了突出的作用。既往真菌病原学物种的鉴定及分类命名主要依据损处组织块或浓汁显微镜及电镜检查、培养观察菌落形态、血清学、组织病理学以及免疫荧光染色等法，这些方法为我国乃至世界的真菌学分类研究奠定了重要基础。

但这些方法特异性不高，随着20世纪90年代以来分子生物学在真菌研究上的飞速发展和广泛应用，近20年来真菌学也有了突出的进步，尤其是通过DNA序列的比较表明基于物种的形态识别往往低估了真菌的多样性。此外，分子生物学和微生物学利用高通量测序的集体种作业方法可以更快速地鉴定菌种[2]。目前，真菌分类已从既往的形态表型分类向分子基因型分类转变，许多现有的真菌病原菌物种名称较以前发生了明显的变化，部分菌种被重新命名，部分菌种新增了多个真菌署名[3]。以DNA序列数据为基础的遗传分类学，较之形态学建立了一个更佳准确、更为稳定的真菌分类平台。

真菌分类系统的变化大大冲击了传统的真菌分类学，参考最近的分子系统发育分析，一个全面的系统分类真菌王国已经诞生，大量新的菌种、属，甚至科、目等更高级、更广泛的分类级别将得到持续的改变与发展[3]。这为进出境检疫等非真菌学研究者的工作与研究带来了不便。因此，新的真菌种名的不断产生意味着检疫系统新的物种检测方法和重点需要持续性更新。

2 孢子丝菌分类的变化

孢子丝菌属存在于真菌界的子囊菌门，真子囊菌纲，长喙壳菌目，长喙壳菌科。它是一种双相病原性真菌[4]，分为环境株和临床株，在环境中主要存在于土壤及植物中[5]。1898年，孢子丝菌由美国人Shenk首次从该病患者患病组织中分离培养出来，被命名为申克孢子丝菌[6]。过去，申克孢子丝菌一直被认为是孢子丝菌属的唯一物种，申克孢子丝菌为孢子丝菌病的唯一致病菌种[7]。随着近期分子生物学及真菌分类研究的快速发展，目前的大量研究证实以前广泛被认可的孢子丝菌形态种其实是由申克孢子丝菌 (Sporothrixschenckii)、球形孢子丝菌 (Sporothrixglobos)、巴西孢子丝菌 (Sporothrixbrasiliensis，S.brasiliensis)、墨西哥孢子丝菌 (Sporothrixmexicana，S.mexicana)、白孢子丝菌 (Sporothrixpallida，S.pallida)、申克孢子丝菌卢艾里变种 (Sporothrixschenckiivarluriei，S.luriei)6个种组成的复合体[8]。

本文学者以核糖体内转录间隔区 (Ribosomal Internal Transcribed Spacer,ITS)序列联合β微管蛋白 (β-tubulin)序列为引物对从我国孢子丝菌病人患处组织分离培养出的临床菌株进行PCR扩增，根据在GenBank中下载的孢子丝菌的基因序列，使用MEGA软件与世界其他地区已发表的基因序列进行对比，采用邻接法 (Neighbor-Joining,NJ)进行系统分析，系统树各分支的置信度以1 000次自引导法 (Bootstrap)重复检测，以通过系统发育树分析证实所鉴定的临床株菌均为球形孢子丝菌[9-12]。此结果与我国其他学者以钙调蛋白 (Calmodulin，CAL)或ITS基因序列为引物报道的文献结论一致[13-15]。近期，已有我国学者报道利用ITS基因序列为引物鉴定为申克孢子丝菌感染的病例[16]。

3 传入风险及潜在威胁

孢子丝菌分布于全球各地，危害甚广，以热带和亚热带地区为主[17]。申克孢子丝菌的感染和分布表现出一定的全球性，在欧洲、美洲、非洲、亚洲均有被发现[4]，球形孢子丝菌的感染主要流行在亚洲、欧洲、美洲[15]，巴西孢子丝菌在巴西区域性分布[18]，墨西哥孢子丝菌主要分布于墨西哥[19]，仅有极少数临床卢艾里孢子丝菌感染被报道[20]，而白孢子丝菌暂未被发现人畜感染[21]。大量分子生物学研究证实，我国目前仅发现球形孢子丝菌及申克孢子菌，而其他复合种在全球分布较广，而目前在我国没有报道[10,16]。

人们通常因外伤后接触被孢子丝菌污染的植物、土壤或呼吸道吸入该菌而致病，故感染者以园艺工作者、农民为主，该菌也可感染狗、猫等动物[22]。孢子丝菌传播途径众多，可在环境中潜伏，为人兽共患性真菌，各复合种间形态差异不大，而在遗传学上有较大差异。通过流行病学调查、表型生长鉴定等方法，孢子丝菌各菌种在地域分布、临床出现频率及表现、致病性、对药物的敏感性均表现出明显差异。小鼠模型研究表明，不同孢子丝菌基因型的毒力、致病性不同导致孢子丝菌临床类型的不同[23]。其中，巴西孢子丝菌和申克孢子丝菌为最致命的物种，致死率及播散率最强，之后依次是球形孢子丝菌墨西哥孢子丝菌，白孢子丝菌毒力最弱[24]。孢子丝菌不同复合种之间存在药物敏感性显著差异，巴西孢子丝菌对抗真菌药物最敏感，最不敏感的是墨西哥孢子丝菌[25]。近几年，孢子丝菌病的发病率及死亡率逐年上升。该病可引起深部及播散性真菌感染，极易误诊漏诊，且敏感抗真菌药物种类少，治疗时间长，药物副作用大，极大危害人类及动物健康。

真菌进出口检疫工作是一种国家主权行为，它是一项严谨且科学技术含量高的工作，其属于国家动植物检疫工作。该项工作的主要目的是为防止危害包括人在内的动植物得病、虫、杂草及其他有害生物由国内传出或者由国外传入，以预防该国家区域内发生较大规模或者广泛传播蔓延的生物入侵。既往受鉴定方法的限制，我国孢子丝菌病患者的病原体均且仅鉴定为申克孢子丝菌[26]，故认为申克孢子丝菌为我国既有真菌，未将其纳入检疫重点。随着孢子丝菌复合种的发现及深入研究，孢子丝菌的物种分类系统已经重建，由于孢子丝菌可通过土壤及植物传播，国外已有报道巴西孢子丝菌等各复合种可引起人或动物大面积传播感染[27]。由于目前缺乏特异性诊断及检测方法，复合种其他病原菌一旦传入我国可能会造成较大面积的传播及感染，有较大风险，为提高海关监管的针对性，维护区域性进出口秩序，保障和保护人民身体健康及环境安全，加强非本土孢子丝菌菌种传入对我国乃至世界的国家检疫性工作具有重要意义，故需要国家检疫加强监管及检测，加强海关监管以避免传入我国。

4 生物安全监测监管建议

随着经济、文化、学术交流的不断全球化，各国之间的往来逐渐紧密频繁，这揭示着我国的进出口检疫工作量将不断增加。孢子丝菌来源于自然环境[28]，它不仅存在于自然环境，也可引起人兽共患，作为未被列入检疫名录的有害生物，若不进行严格的检疫和防范措施，其他复合种的传入可引起严重的危害。

目前，多基因系统学的发展已可以稳定的分类鉴定出孢子丝菌复合种，但国内仅有少数几个实验室开展过相关研究并具备识别区分这些物种的技术能力，且这些技术还处在"实验室及临床探索"阶段，暂未普及，海关监测相对薄弱，因此应尽快建立多基因识别技术体系帮助口岸部门具备相应的识别能力，同时积极研发特异性检测方法以高效、快速识别复合种菌株。同时，我国边境检疫部门应对孢子丝菌模式菌株标本进行统一收集、管理、评估，以方便工作人员在实际工作过程明确检疫对象。对于已经在环境及临床中发现的孢子丝菌菌株，需定期追踪相关信息。

综上所述，在真菌分类学日新月异发展的今天，真菌的检疫也需要及时、规范地进行更新、调整以适应时代的需求。我国海关应及时建立孢子丝菌复合种参考菌株及参考序列的监测系统，参考多基因鉴别孢子丝菌复合种的标准方法及检疫菌物的行业规范等以帮助口岸检疫部门迅速建立对孢子丝菌的检测监测能力。

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