纳米沉淀法及其在纳米药物载体领域的应用研究进展

李 艳 罗 成 周 婕

(宜春学院医学院，江西 宜春 336000)

纳米沉淀法及其在纳米药物载体领域的应用研究进展

李 艳 罗 成*周 婕

(宜春学院医学院，江西 宜春 336000)

纳米材料在生物医学领域具有广泛的应用。纳米沉淀法通过控制溶质溶液与非溶剂的混合制备纳米颗粒，反应快速，适用于多种纳米颗粒的制备。近年来纳米沉淀法领域已取得大量研究进展，基于混合器的Flash纳米沉淀技术以及基于水动力聚焦的微流控纳米沉淀技术的出现，提高混合效率和对反应条件的控制性，为高质量纳米颗粒的规模化制备提供条件。纳米沉淀法被广泛用于各种纳米颗粒以及药物载体(姜黄素、紫杉醇、阿霉素、喜树碱、顺铂、青霉素等)的制备，对其近年来的研究进展进行总结归纳。

纳米颗粒；纳米沉淀；药物载体；荧光标记纳米颗粒

引言

纳米材料通常是指在三维尺度中至少有一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元构成的材料，在生物医学领域具有广泛的应用。纳米沉淀法通过控制两种溶液的混合来制备纳米颗粒，其一般过程是：有机溶剂中的疏水性溶质与非溶剂(通常为水)混合时产生局部过饱和，进而析出生成纳米颗粒[1]。纳米沉淀法操作简单，条件温和，产物粒径可以通过反应条件进行调节，被广泛用于各种纳米颗粒的制备，包括双亲性天然分子衍生物、人工合成聚合物、配位聚合物等[2-5]。反相纳米沉淀法(水作为溶剂)被成功用于亲水性蛋白质纳米颗粒的制备[6-7]。反应的混合方式也从传统的滴加-搅拌、透析等发展到混合器的使用，特别是基于对冲碰撞混合器和多入口旋涡混合器的Flash纳米沉淀技术(FNP)[8-9]，以及基于水动力聚焦的微流控纳米沉淀技术，提高了反应混合效率和对实验条件的控制性，为高质量纳米颗粒的制备提供了条件。近年来，纳米沉淀法的应用从简单的纳米颗粒制备扩展到各种药物载体以及复合纳米颗粒等，在生物医学领域具有广阔的应用前景。下面将按照应用分类，对近年来纳米沉淀法领域的研究进展进行总结归纳。

1 纳米颗粒制备

多种材料均可以利用纳米沉淀法制备纳米颗粒，其中比较常见的包括多糖及衍生物(纤维素酯[2-3]、右旋糖酐酯[10]、烷基化壳聚糖[11]等)、人工合成聚合物(聚乳酸[12]、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)[4]、聚甲基丙烯酸甲酯[5]、聚甲基丙烯酸[13]、聚苯乙烯[14]、聚砜[15]等)、配位聚合物[16-17]以及蛋白质[18]等。

1.1 多糖及聚合物纳米颗粒

Geissler等利用滴加或透析的方式，制备不同分子量纤维素硬脂酸酯的纳米颗粒[3]。纳米颗粒平均粒径依赖于纤维素硬脂酸酯的浓度、分子量以及溶液的混合方法，透析法制备的纳米颗粒粒径要大于滴加-搅拌法制备的结果。Xie等制备了粒径大小为140～500 nm的PLGA纳米颗粒[4]。含有PLGA的乙腈溶液注入分散通道时，在含有表面活性剂的水溶液剪切作用下，形成微小液滴并最终形成纳米颗粒。纳米颗粒粒径受水溶液流速、PLGA浓度以及水溶液中甲醇的比例共同影响。Phillips等制备了热响应性聚异丙基丙烯酰胺的纳米颗粒[19]，分子链末端带有二硫键连接的“溶解性擒纵器”，在谷胱甘肽的作用下，二硫键被还原，聚合物溶解度改变，纳米颗粒解体，实现聚合物纳米颗粒的等温刺激响应性。Bally等利用多片层微混合器辅助的纳米沉淀技术，实现聚甲基丙烯酸纳米颗粒(粒径范围75～217 nm)的连续制备[13]；Zhang等利用FNP，制备聚苯乙烯纳米颗粒[14]，颗粒的尺寸可以通过聚苯乙烯或电解质(氯化钠)的浓度进行调整。当粒径小于150 nm时，FNP方法与无皂乳液聚合法制备的纳米颗粒具有相似的粒径分布；利用传统的纳米沉淀法制备聚砜纳米颗粒时，残留的溶剂容易导致生成的纳米颗粒发生粒径生长和聚集。为了解决这个问题，通过在纳米颗粒生成后引入乙酸乙酯终止反应，可以得到分散良好的聚砜纳米颗粒[15]。

1.2 配位聚合物纳米颗粒

Tang等利用FNP，制备包裹抗氧化剂单宁酸的纳米颗粒[16]。将分散在有机相中的单宁酸、聚苯乙烯-聚乙二醇嵌段共聚物与含有铁离子的水溶液混合，铁离子和单宁酸生成不溶性配位聚合物并形成纳米颗粒，嵌段共聚物结合在颗粒表面得到水分散性纳米颗粒。调整核心材料(单宁酸-铁)和聚合物的比例，可以得到粒径大小50～265 nm的纳米颗粒。该纳米颗粒具有pH响应性，在pH 7.4时稳定，在酸性环境下溶解释放出单宁酸。Yang等以1,1′-二茂铁二羧酸和Gd3+离子为原料，利用纳米沉淀法制备配位聚合物纳米颗粒[17]，纳米颗粒表面经硅烷偶联剂修饰氨基后，交联罗丹明染料RBITC和肿瘤细胞靶向性RGD多肽。该纳米颗粒具有较低的细胞毒性，能同时用作T1和T2周期核磁共振造影剂。

1.3 其他纳米颗粒

以(3-巯基丙基)-三甲氧基硅烷(MPTMS)和(3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷(APTMS)作为有机硅前驱体，在二甲基亚砜中预孵育后与水混合，即得到二氧化硅纳米颗粒[20]。MPTMS和APTMS的比例对纳米颗粒的生成具有重要影响，控制两者的比例，可以得到粒径范围130～150 nm的纳米颗粒。

Li等利用反相FNP，制备玉米蛋白纳米颗粒[18]。玉米蛋白溶解在乙醇-水(80∶20)混合溶液中，去离子水作为非溶剂，两种液体通过限制对冲碰撞混合器来混合，得到玉米蛋白纳米颗粒，其粒径可以通过玉米蛋白溶液的流速和混合器的出口结构进行调整。

2 纳米颗粒表面修饰

在纳米沉淀法中，通过在溶剂中加入纳米颗粒，使溶质分子结合在纳米颗粒表面，可以实现纳米颗粒的表面修饰。Bui等将两亲性嵌段共聚物组装在siRNA-聚乙烯亚胺(PEI)纳米颗粒表面[21]。带有相反电荷的PEI和siRNA组装为正电性的纳米颗粒，分散进入含有透明质酸-聚谷氨酸苄酯嵌段共聚物(HYA-b-PBLG)的二甲基亚砜中；HYA-b-PBLG分子中带有负电性的HYA部分通过静电作用，结合在纳米颗粒表面，形成单层聚合物层。向混合溶液中加入水溶液，降低了游离HYA-b-PBLG分子中PBLG部分的溶解性，PBLG部分与纳米颗粒表面结合的HYA-b-PBLG分子通过疏水相互作用，在纳米颗粒表面形成病毒衣壳样聚合物双分子层，该siRNA-PEI复合体具有较高的基因沉默活性。Kim等通过纳米沉淀法，将亲水性普朗尼克F127分子组装在二巯基化聚己内酯修饰的金纳米棒表面[22]，提高了金纳米棒的稳定性和生物相容性。

3 药物载体

纳米沉淀法被广泛用于各种药物载体的制备，如姜黄素[23-24]、紫杉醇[25-27]、阿霉素[28-32]、喜树碱[33-34]、顺铂[35-37]、青霉素[38]等。根据药物分子在纳米沉淀法中起的作用，可以分为3类：第1类是药物分子在聚合物纳米颗粒生成过程中，被动包裹在颗粒内部；第2类是药物分子与其他分子交联后，共同组装为纳米颗粒；第3类是药物分子直接形成纳米颗粒，形成无载体超高载药量药物纳米颗粒。

3.1 被动包裹

将药物分子和聚合物等共同溶解在溶剂中，聚合物形成纳米颗粒的同时将药物分子包裹在纳米颗粒内部，该方法操作简单，被广泛用于各种药物载体的构建。

3.1.1 疏水性药物

经典的纳米沉淀法通常适用于包裹疏水性药物。Yallapu等构建了负载姜黄素的PLGA纳米颗粒[23-24]，与游离姜黄素相比，纳米颗粒能够有效抑制前列腺癌细胞的增殖和克隆形成能力，抑制肿瘤移植瘤模型中肿瘤的生长。纳米颗粒表面交联前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体后，可以实现肿瘤细胞靶向性，提高纳米颗粒的肿瘤治疗潜力。Anton等利用射流微混合器，实现了包裹酪洛芬的聚甲基丙烯酸甲酯纳米颗粒的连续制备[5]，调整溶剂和非溶剂的流速可以改变纳米颗粒的物理特性和药物包裹/释放特性。Karnik等制备了包裹多烯紫杉醇的聚乳酸乙醇酸-聚乙二醇嵌段共聚物纳米颗粒[25]。Ge等将牛血清白蛋白(BSA)与聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)交联[34]，BSA-PMMA自组装为纳米颗粒，PMMA位于颗粒内部，亲水性BSA位于纳米颗粒表面。纳米颗粒尺寸和表面电荷可以通过BSA：PMMA的比例和聚合物的浓度进行调节，在溶剂中加入疏水性喜树碱，可以得到内部负载喜树碱的纳米药物载体。

3.1.2 亲水性药物或生物大分子

为了将亲水性核酸分子包裹在颗粒内部，Tahara等将核酸分子与阳离子性1,2-二油酰-3-三甲胺基丙烷(DOTAP)形成的离子复合物溶解在有机溶剂中[39]，实现核酸在PLGA纳米颗粒中的包裹。

反相纳米沉淀法的出现，也为亲水性分子的包裹提供了可能。Khan等制备了明胶纳米颗粒，并将异硫氰酸荧光素标记的右旋糖酐作为模式亲水分子包裹在纳米颗粒内部[6]；Steinhilber等制备了聚甘油纳米凝胶，利用铜催化的点击化学，实现纳米凝胶的原位交联，并在纳米凝胶连接处引入pH敏感基团[7]。聚甘油纳米凝胶在生理pH下可以长时间保持稳定，而在炎症或肿瘤组织等酸性条件下快速降解成低分子量的片段。天冬酰胺酶被成功包裹到纳米凝胶内，并保持了活性和结构完整性。

3.2 与其他分子交联后共组装

除被动包裹外，可以把药物分子与其他分子交联，利用纳米沉淀法将它们共同组装为纳米颗粒。该方法通常要求药物分子具有一定反应性基团，制备过程相对复杂。利用刺激响应性基团进行交联，可以实现药物分子的响应性释放。

为了克服紫杉醇的系统毒性和较低的水溶性，Caron等将紫杉醇和角鲨烯通过顺式二烯分子连接链构建前药分子，并利用纳米沉淀法制备纳米颗粒[40]。调整连接链长度、空间位阻和功能基团，药效最优的前药分子与母体药物相比具有相当的抗肿瘤活性，但是亚急性毒性显著降低。该药物载体对几种肿瘤细胞系，包括肺A549细胞、结肠癌细胞HT-29和KB3.1鼻咽癌表皮样细胞，均具有显著的细胞毒性。

顺铂和多烯紫杉醇对前列腺癌具有协同治疗作用。Kolishetti等将聚乳酸(PLA)与顺铂前药交联形成PLA-Pt(IV)，与PLGA-聚乙二醇嵌段共聚物和多烯紫杉醇混合后制备纳米颗粒[35]。该方法对亲水性顺铂前药和疏水性多烯紫杉醇都具有很高的包裹率和载药量，纳米颗粒表面交联A10适配体后，能够与前列腺细胞表面的PSMA有效结合。

Shen等将喜树碱与乙二醇低聚物链结合，得到的双亲性前药分子能够自组装为脂质体样纳米囊泡，喜树碱的载药量可以达到40%～58%[41]。纳米囊泡可以同时负载水溶性阿霉素，实现对肿瘤细胞的协同治疗。

Zhang等制备了pH和氧化还原双响应性聚甘油前药纳米凝胶，分枝状聚甘油通过二硫键交联，阿霉素与凝胶基质通过酸敏感的腙链交联[42]。该双响应前药纳米凝胶能够在细胞内还原性环境和酸性环境下选择性释放，非特异性药物释放很少。

抗生素药物较低的细胞扩散效率导致致病菌药物抵抗，为治疗致病菌导致的细胞内感染，Sémiramoth等将青霉素G与角鲨烯通过pH敏感型化学键交联来制备纳米颗粒[38]。治疗细胞内金黄色葡萄球菌感染时，纳米颗粒与游离青霉素G相比具有较高的抗菌活性。

3.3 无载体药物纳米颗粒

被动包裹法制备药物载体时，聚合物分子占据纳米颗粒的绝大多数比重，因此载体的载药量较低。直接将药物分子组成纳米颗粒(无载体药物纳米颗粒)，可以减少惰性载体材料所占的比重，提高载药量，该方法多适用于疏水性药物纳米颗粒的制备。

Zheng等在超声处理下，向姜黄素的乙醇/水溶液中加入含有正电性聚烯丙胺盐酸盐(PAH)的水溶液，制备了PAH修饰的姜黄素纳米颗粒，对将黄素的载药量可以达到80%～90%[43]。Li等制备了10-羟基喜树碱的纳米颗粒，纳米颗粒载药量可以达到78%以上，并利用连接有叶酸的两亲性表面活性剂稳定纳米颗粒，同时实现纳米颗粒的靶向性修饰[44]。将3种疏水性药物(氨甲蝶呤、10-羟基喜树碱和紫杉醇)共同溶解在有机相中，利用类似的方法可以制备多药复合纳米颗粒，药物之间的协同作用使复合纳米颗粒比单纯药物纳米颗粒具有更高的细胞毒性，动物模型实验同样表明复合纳米颗粒具有更好的抗肿瘤效果[45]。McDonald等制备了抗菌药二氯苯氧氯酚的纳米颗粒(170～290 nm)[46]。与药物水溶液相比，利用Pluronic F68和阳离子表面活性剂季铵盐制备的药物纳米颗粒对大肠杆菌的半数抑制浓度(IC50)降低到原来的1/10。

4 其他纳米颗粒制备

4.1 荧光纳米颗粒

4.1.1 共轭聚合物纳米颗粒

共轭聚合物纳米颗粒，特别是小粒径纳米颗粒(聚合物点)，在荧光成像和生物传感领域具有广泛的应用。Behrendt等利用纳米沉淀法，制备聚(9,9-二辛基芴)(PFO)的纳米颗粒，将部分辛基侧链替换为短PEG链，可以得到表面PEG修饰的纳米颗粒，同时降低纳米颗粒粒径[47]。Ye等制备了橙色荧光的氰基，取代聚对苯撑乙烯(CN-PPV)纳米颗粒(～10 nm)[48]。在纳米颗粒制备过程中，加入苯乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物，顺丁烯二酸酐水解后在纳米颗粒表面形成羧基基团，实现纳米颗粒表面功能化。纳米颗粒表面交联链霉亲和素后，与生物素标记的抗体结合，能够用于细胞表面标记以及细胞内微管标记；在9,9-二辛基聚芴-苯并噻二唑交替共聚物(PFBT)纳米颗粒中掺杂近红外染料NIR775，由于PFBT的强吸光能力以及荧光共振能量转移作用，NIR775的荧光亮度显著增强，与相同尺寸近红外量子点ITK Qdot800相比具有4倍的亮度[49]；将温度响应性染料罗丹明B包裹在共轭聚合物纳米颗粒内，单波长激发下纳米颗粒的荧光强度I573 nm/I510 nm比率变化与温度在一定范围内成线性相关，从而制备得到比率式温度传感器[50]。

4.1.2 包裹染料或量子点荧光纳米颗粒

通过在纳米颗粒制备过程中加入荧光染料或量子点，可以制备得到荧光纳米颗粒。Akbulut等将疏水性或疏水性修饰荧光染料(尼罗红、香豆素、芘等)包裹在双亲性嵌段共聚物纳米颗粒中，荧光发射峰位置涵盖370～720 nm[51]。与游离染料相比，荧光纳米颗粒稳定性较高，没有光漂白发生；通过在聚合物分子链中引入带负电的羧基、磺酸基或带正电的三甲基铵基团，可以制备得到超小的聚合物纳米颗粒(20 nm)，并有效包裹离子型染料，荧光强度比相同尺寸量子点亮10倍。该方法具有普遍适用性(PLGA、聚已酸内酯和聚甲基丙烯酸甲酯)，降低聚合物的浓度可以进一步得到15 nm的颗粒[52]。Wang等将疏水性聚集诱导发光染料EDP包裹到聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物纳米颗粒内，得到高荧光亮度的纳米颗粒[53]；Zhang等将CdSe-ZnS量子点包裹在双亲性聚合物胶束内，添加疏水性均聚物可以避免量子点的自猝灭作用[54]。改变溶剂/非溶剂比例、嵌段共聚物组成和分子大小、均聚物浓度和混合器的排列，可以得到粒径90～800 nm的纳米颗粒。

4.2 复合纳米颗粒

在聚苯乙烯-b-聚(4-乙烯基吡啶)嵌段共聚物的四氢呋喃溶液与含有HAuCl4或H2PtCl6的水溶液混合后，将其进一步稀释到含有NaBH4和稳定剂的水溶液中，得到稳定分散的聚合物纳米颗粒；同时，HAuCl4或H2PtCl6在NaBH4的还原下生成Au或Pt分布在纳米颗粒表面。纳米颗粒形状、金属纳米颗粒粒径和整体的光学特性，可以通过制备参数进行调节[55]。

Yan等制备了miglyol核心、环氧基团功能化的含糖聚合物纳米囊，表面环氧基团可以用于染料和磁性纳米颗粒的交联[56]。在纳米囊表面，多个庚基甘露糖基团可以与大肠杆菌表面的凝集素糖结合位点作用，利用负载荧光染料和磁性纳米颗粒的纳米囊，可以方便地观察细菌的聚集，同时实现细菌的磁性分离。

实现药物在病变位点的可控释放，可以有效减少药物对机体其他组织的副作用，提高疾病治疗效果。Kong等制备了包裹疏水性磁性纳米颗粒和喜树碱的卵磷脂-PLGA杂合纳米颗粒[57]，磁性纳米颗粒和喜树碱包裹在PLGA核心内，颗粒表面由单层磷脂和脂质-聚乙二醇稳定，利用远程射频磁场可以实现药物的刺激响应性释放。Sanson等制备了聚三亚甲基碳酸酯-聚谷氨酸(PTMC-b-PGA)嵌段共聚物囊泡，并将疏水性γ-Fe2O3纳米颗粒组装在双层聚合物分子中的疏水区域[58]。聚合物囊泡负载阿霉素后，可以实现核磁共振成像和射频磁高热诱导的阿霉素可控释放。

5 总结与展望

纳米沉淀法具有制备过程简单、条件温和等优势，被广泛用于各种纳米颗粒、纳米药物载体以及复合纳米颗粒的制备。近年来，FNP技术的发展以及先进的自动化、高通量技术(如微流控技术、移液机器人[59]等)在纳米沉淀法中应用，可以实现反应体系的快速混合，并方便地对制备参数(液流速度、聚合物浓度、溶剂/非溶剂比例等)进行调节，实现纳米颗粒制备的自动化、规模化和连续化，对于推动纳米技术的实际应用具有重要意义。随着材料科学和纳米科学的发展，纳米沉淀法有望得到进一步发展和完善，特别是对亲水性生物大分子的适用性以及多模态复合功能材料的制备等，其应用也将得到进一步拓展。

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Recent Advances of Nanoprecipitation and its Applications in Nano-drug Carriers

Li Yan Luo Cheng*Zhou Jie

(SchoolofMedicine,YichunUniversity,Yichun336000,Jiangxi,China)

Nanomaterials have shown their great potentials of wide applications in biomedical fields. Nanoprecipitation is a facile and straight approach to fabricate various nanomaterials through the supersaturation of solutes when mixing with nonsolvent. Recently a great progress has been made in the fabrication technologies, especially the Flash nanoprecipitation and microfluidic nanoprecipitation, which has greatly improved the reaction efficiency and controllability, paving the way for large-scale preparation of nanoparticles with high quality. Up to date, nanoprecipitation has been utilized to fabricate various nanoparticles and drug carriers (curcumin, paclitaxel, doxorubicin, camptothecin, cisplatin, penicillin, etc.). The research progresses in nanoprecipitation are summed up in this review.

nanoparticles; nanoprecipitation; drug carriers; fluorescent nanoparticles

10.3969/j.issn.0258-8021. 2017. 04.013

2017-03-17，录用日期: 2017-05-23

江西省自然科学基金 (20161BAB215196); 江西省教育厅科学技术资助项目 (GJJ151021)

R318

A

0258-8021(2017) 04-0483-07

*通信作者(Corresponding author)，E-mail: luocheng999@163.com