蓝莓煤污病病原菌鉴定及防治药剂筛选

岳清华+董克锋+高勇+廖甜甜+胡博+姜惠铁

摘 要：采用单孢分离法分离病原菌，并通过症状观察、形态学、分子生物学、回接方法对病原菌进行鉴定，结果表明，引起蓝莓煤污病的优势病原菌有3种，即尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum）、枝细枝孢（Cladosporium ramotenellum）、交链格孢（Alternaria alternate）。为筛选防治蓝莓煤污病的有效药剂，选择7种杀菌剂进行田间药效试验，其中10%多抗霉素、500 g/L异菌脲对蓝莓煤污病防治效果较好，施药4周后相对防效分别达到78.56%、64.09%。

关键词：蓝莓；煤污病；病原菌鉴定；药效

中图分类号：S436.63文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）12-0121-03

Abstract The pathogens of sooty mould in blueberry were isolated with single spore separation， and were conformed through symptom observation， morphological and molecular biological identification and back inoculation. The results showed that the dominant pathogens were Cladosporium oxysporum， Cladosporium ramotenellum and Alternaria alternate. To screen effective agents to control the sooty mould in blueberry， seven fungicides were selected for field efficacy trials. Among which， 10% polyoxin and 500 g/L iprodione had good effects against blueberry sooty mould， and the relative control effects reached 78.56% and 64.09% respectively after application for 4 weeks.

Keywords Blueberry； Sooty mould； Pathogenic identification； Fungicide effect

蓝莓，学名越橘，杜鹃花科越橘属（Vaccinium spp.）植物，小浆果树种[1]。蓝莓果实含有大量对人体健康有益的物质，常食对人的眼睛有良好的保健作用，还可以清除体内自由基，增强毛细血管柔韧性、预防血栓形成、抵抗泌尿系统感染、抑制癌细胞增殖等[2]。

蓝莓煤污病近几年在胶南地区蓝莓园经常发生，初期症状为叶片、枝条上有黑色霉点，后在枝条、叶片上形成深暗绿色点状霉层，严重时可连结成片，直至翌年春天。该病影响植株光合作用，树势衰弱。本研究对蓝莓煤污病的病原菌进行了鉴定，并选择了7种高效低毒杀菌剂进行田间试验，为蓝莓煤污病的有效防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病害症状观察与病原菌鉴定

于山东省胶南地区蓝莓生产基地，观察蓝莓煤污病症状。选择症状明显的蓝莓煤污病叶片，挑取煤污霉层，无菌水稀释后采用单孢分离法[3]分离病原菌。分离后在PDA培养基上纯培养，进行形态学与分子生物学鉴定。分子生物学鉴定交由第三方检测机构上海生工生物有限公司进行鉴定并出具报告。

用分离到的病原菌孢子悬浮液做接种物，浓度为1×107个孢子/mL，选择高20 cm的蓝莓钵苗进行接种试验。接种前先将10%浓度的蜂蜜水喷洒于蓝莓叶片上，后喷洒孢子悬浮液。以清水作为对照。喷洒完成后，恒温28℃、湿度95%以上培养观察。

1.2 药剂选择与施药方法

选择样地内树体大小一致、煤污黑斑程度基本相近的树作为试验对象。选择7种药剂（见表1）进行试验，浓度为药剂推荐浓度。设清水对照。每处理3棵蓝莓树，重复3次。药剂喷施时以叶面喷施均匀、药剂不下滴为准。

1.3 病害调查方法

喷药2、4周后，每棵树选择东南西北4个方向各5个枝条，挂牌。统计枝条上的总叶片数、不同病级叶片数，计算病叶率、病情指数和相对防效。

病情分级标准：0级：无黑斑；1级：黑斑面积占叶片面积的25%及以下；2级：黑斑面积占叶片面积的26%～50%；3级：黑斑面积占叶片面积的51%～75%；4级：黑斑面积占叶片面积的76%及以上。

2 结果与分析

2.1 症状观察

蓝莓叶片正面、枝条上附着暗绿色霉层，初期点状分布，后逐渐扩大至全叶及枝条，霉层厚而疏松（如图1），影响植株的光合作用。该病春季主要发生于冬暖棚，棚内通风不良湿度增大，诱导该病发生，夏末雨季高温潮湿易诱发大田煤污病。

2.2 病原菌鉴定

经形态学及分子生物学鉴定，引起蓝莓煤污病的3种优势病原菌为尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum）[4]、枝细枝孢（Cladosporium ramotenellum）[4]、交链格孢（Alternaria alternate）[5]。

尖孢枝孢：在PDA培养基上28℃恒温黑暗培养7 d后，菌落直径达35 mm，菌落正面为深橄榄绿色，菌落边缘近深灰色，背面深灰黑色，气生菌丝短而致密；分生孢子椭圆形、柠檬形或近球形，无色或淡褐色，光滑，0～2个隔膜，分生孢子大小（2～5.6）μm ×（1.8～3.6）μm。经分子生物学鉴定，分离获得菌株的ITS序列提交到GenBank比对，与登录号为KT936546的菌株Cladosporium oxysporum同源性达100%。结合形态学和分子生物学鉴定结果确认该病菌为C.oxysporum。

枝细枝孢：在 PDA 培养基上28℃恒温黑暗培养 7 d后，菌落直径达65 mm，菌落平展，粉状，近橄榄绿色，背面橄榄褐色，菌落有细微轮纹；分生孢子球形、近球形或卵形，单胞，（2.8～6.8）μm×（2.0～3.9） μm。经分子生物学鉴定，分离获得菌株的ITS序列提交到GenBank比对，与登录号为KP701972的菌株Cladosporium ramotenellum同源性达100%。结合形态学和分子生物学鉴定结果确认该病菌为C.ramotenellum。

交链格孢：在PDA培养基上28℃恒温黑暗培养3 d后，菌落直径达50 mm，菌落致密，深墨绿色，中夹杂灰色菌丝，背面呈黑褐色，有轻微同心轮纹，；分生孢子倒棒形，褐色，常有喙，有纵隔膜1～2个，横隔2～5个，横隔处有缢缩现象，大小为（11.5～30.5）μm × （6. 8～12.9）μm。经分子生物学鉴定，分离获得菌株的ITS序列提交到GenBank比对，与登录号为KU179665的菌株Alternaria alternate同源性达99%。结合形态学和分子生物学鉴定结果确认该病菌为A.alternate。

2.3 病原菌回接

将接种钵苗保湿培养3 d后，叶片上即可看见少许小点状霉层长出，清水对照未发病，待典型病斑形成后，挑取少许霉层进行显微镜观察，经验证与田间发病所观察情况一致，进一步证明3种优势菌为蓝莓煤污病病原菌。

2.4 药剂筛选

如表2所示，试验选择的7种药剂对蓝莓煤污病的防治效果差异较大。其中10%多抗霉素防治效果最好，施药4周后病情指数由施药前的13.37下降到4.17，相对防效达78.56%，500 g/L异菌脲次之，施药4周后病情指数由12.21下降到6.99，相对防效达64.09%，二者间差异不显著。其余5种药剂效果较差，相对防效均未超过50%，且五者间差异不显著。

3 讨论与结论

经过形态学及分子生物学鉴定，引起胶东半岛蓝莓煤污病的优势病原菌为尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum）、枝细枝孢（Cladosporium ramotenellum）、交链格孢（Alternaria alternate）。枝孢霉是引起多种植物煤污病的主要种群，如黄瓜煤污病[6]、柑橘煤污病[7]、小麦煤污病[8]等。C.ramotenellum是一种海洋真菌[9]，目前还没有引发病害的报道。C.oxysporum可以引起辣椒叶斑病[10]，A.alternate可引起多种植物病害，如梨黑斑病[11]、枣斑病[12]、杨叶枯病[13]、番茄黑斑病[14]等。

由药剂防治试验可知，10%多抗霉素和500 g/L异菌脲对蓝莓煤污病的防治效果优于其它5种药剂，施药4周后病情指数下降较快，相对防效分别为78.56%和64.09%，可在防治蓝莓煤污病时应选择10%多抗霉素与500 g/L异菌脲交替使用，以免病原菌产生抗药性。

蓝莓煤污病春季发生于冬暖大棚，此时如果棚内爆发蚜虫，蚜虫分泌的蜜露会诱发并加重煤污病的发生，所以春季防治蚜虫也是预防煤污病发生的一个重要因素，同时棚内要开棚透风，避免湿度过大。蓝莓煤污病也少量发生在果实上，在萼洼处出现厚霉层，蓝莓煤污病对蓝莓果实采后储存是否有影响，还要进一步做储藏试验验证。

参 考 文 献：

[1]赵洪海，李保华.山东省蓝莓种植业的现状、影响因素与对策[J].落叶果树，2012，44（1）：16-19.

[2] 张玉萍.越橘的保健作用及其在我国的开发利用前景[J].山西农业科学，2006，34（4）：22-25.

[3] 董娟华，罗丽，王彩霞，等.一种强寄生病原真菌的分离方法——毛细管打孔分离法[J].中国农学通报，2009，25（3）：210-212.

[4] 张中义.中国真菌志（第14卷）枝孢属、黑星孢属、梨孢属[M].北京：科学出版社，2003.

[5] 张天宇.中国真菌志（第16卷）链格孢属[M].北京：科学出版社，2003.

[6] 张玉华，王立新，郑是琳，等.中国叶围煤污菌初探Ⅲ.黄瓜叶围煤污菌的研究[J].微生物学报，1994，34（6）：469-474.

[7] 周小燕，张斌，耿坤，等.柑橘煤污病病原菌的研究[J].菌物学报，2013，32（4）：758-763.

[8] 王立新，王向积，姜广正.小麦煤污病菌的种群组成与分布研究[J].山东农业大学学报，1993，24（4）：370-373.

[9] 李长林，李伟.分离自海洋环境的枝孢属三个中国新纪录种[J].菌物学报，2014，33（4）：932-936.

[10]黄欣阳，刘志恒，杨红，等.辣椒叶斑病的病原菌生物学特性研究[J].园艺学报，2013，40（2）：275-282.

[11]王宏，常有宏，陈志谊.梨黑斑病病原菌生物学特性研究[J].果树学报，2006，23（2）：247-251.

[12]王军，辛玉成.冬枣黑斑病病原的分离与鉴定[J].青岛农业大学学报（自然科学版），2007，24（1）：21-23.

[13]孙仲平，马文海，王占斌.杨叶枯病病原菌生物学特性初步研究[J].中国森林病虫，2007，1（1）：4-6.

[14]乔镜澄，麻杰.番茄黑斑病病原菌-链格孢菌的分离与鉴定[J].内蒙古农业大学学报，2015，36（6）：91-94.