东北林蛙输卵管上皮细胞的培养质量控制管理

张松玲，何威，王强，李胜男，路晓玉

1.吉林省生物研究所生化研究室，吉林长春 130012；2.长春市中医院脑病科，吉林长春 130000；3.吉林省生物研究所羊草研究室，吉林长春 130012

东北林蛙输卵管上皮细胞的培养质量控制管理

张松玲1，何威2，王强1，李胜男1，路晓玉3

1.吉林省生物研究所生化研究室，吉林长春 130012；2.长春市中医院脑病科，吉林长春 130000；3.吉林省生物研究所羊草研究室，吉林长春 130012

目的 探讨分析东北林蛙输卵管上皮细胞的培养，并对其质量控制进行分析研究。方法 该文对东北林蛙输卵管上皮细胞进行分离和纯化，对细胞培养所需要的条件及试剂进行比较优化，对东北林蛙输卵管上皮细胞进行培养传代。结果 通过上述分离方法分离获得林蛙输卵管上皮细胞，通过台盼蓝染色看出活细胞达95%以上，分离方法可行。通过显微镜观察发现，分离所得的输卵管细胞为圆饼状，胞浆饱满，细胞核清晰可见，呈悬浮状态，培养24 h后，细胞大部分都处于贴壁状态，多数伸展呈卵圆形，类似眼睛状，成簇生长，排列紧密，7 d后长满培养瓶瓶底，开始传代培养。结论 该研究建立的东北林蛙原代输卵管上皮细胞分离培养方法可获纯度较高的输卵管上皮细胞，值得实验室细胞培养质量控制管理。

东北林蛙输卵管上皮细胞；细胞培养；质量控制

东北林蛙是生长在东北山区的纯野生动物，是集药用、食补、美容功能于一体的珍稀两栖类动物。东北林蛙是食、药两用的珍贵蛙种，由于其营养价值高，俗称“大补品”，林蛙油自古以来被认为是滋补强壮剂，可补虚强精壮阳，养肺滋肾益肝。可治疗肾亏劳损、神经衰弱、心慌失眠、溢汗不止、身体虚弱等一切消耗性疾病[1]。林蛙皮具有抗癌、抗炎、保湿、美容等。林蛙卵具有调节血脂、抗疲劳、抑制中枢神经的作用。因此，合理开发利用东北林蛙具有重要的意义。输卵管作为输送受精卵的场所，其上皮细胞为输送精子、受精卵早期胚胎发育提供良好的材料[2]，针对东北林蛙独有的药用价值和天然的利用资源，其输卵管上皮细胞的形态特点成为研究的热点。该文通过分离培养东北林蛙输卵管上皮细胞，对其培养条件进行作用质量控制，建立了完整的东北林蛙细胞体外分离培养的方法，为今后进一步研究东北林蛙输卵管上皮细胞的生长、分化代谢、细胞因子研究等提供良好的实验模型，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该文选取20只东北林蛙均捕自吉林省长白山地区。均为产卵前雌性林蛙。

1.2 主要试剂

培养基DMEM/Hanks液是sigma公司产品，加0.005 7 g青霉素1 750 U/mg，0.05 g链霉素100 mg/L，50 mL胎牛血清（37℃水浴至融化），调节pH为7.2～7.4，0.22 μm滤膜过滤后使用，4℃保存。10%～15%胎牛血清(FCS)购自北京鼎国生物公司，灭活后使用。胰蛋白酶是sigma公司产品，用D-Hanks液配成0.25%浓度。调节pH为7.2～7.3。DMSO购于sigma公司。

1.3 东北林蛙输卵管上皮细胞的分离质量控制管理

首先处死林蛙，在无菌环境下迅速取出林蛙输卵管，剪下输卵管壶腹部放入于灭菌小平皿中，用含青链霉素的D-Hank’s液漂洗2～3次，清洗掉血液组织后用组织剪进行剥离，去掉周围粘连的组织，分离出完整的输卵管。然后迅速剪碎输卵管，加入适量 0.25%胰蛋白酶，37℃培养箱内消化30 min，加入含15%血清DMEM培养液终止消化。消化过程中要吹打数次以便内膜消化充分。然后装入离心管内，800 r/min离心10 min，弃上清。沉淀部分再用DMEM培养液漂洗2次，800 r/min离心10 min，弃上清。加入含15%血清DMEM培养液制成细胞悬液。经台盼蓝染色判断细胞活性并进行细胞计数，显微镜下观察细胞活性大于95%即为活性良好。

1.4 东北林蛙输卵管上皮细胞的培养质量控制管理

取上述细胞悬液，调整细胞浓度为5×102个/mL接种于6孔培养板中，每孔加入细胞悬液 3 mL，置37℃、5%CO2的培养箱中培养。每3～4天 换1次培养液。待细胞长满培养板底层后，即进行传代。首先小心吸取培养板中的培养液，用含青链霉素的D-Hank’s液漂洗2～3次，加入0.25%胰蛋白酶2 mL放入37℃、5%CO2的培养箱中消化5～10 min，显微镜下观察贴壁细胞收缩变圆悬浮立即加入含15%血清DMEN培养液终止消化，800 r/min离心10 min，弃上清。加入含15%血清DMEN培养液，吹打制成悬液，然后调节细胞数为2×105个/mL接种于新培养板中，放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。定时换液并注意观察细胞形态。

1.5 东北林蛙输卵管上皮细胞的冻存与解冻质量控制管理

将上述经胰酶消化的林蛙输卵管上皮细胞一部分放入培养瓶中继续培养，另一部分制成单细胞悬液，用含10%DMSO和20%血清的培养液稀释成细胞浓度为5×106/mL的混悬液，迅速加入冷冻管中，首先放入4℃冰箱中30 min，然后放入-20℃冰箱2 h，然后放入-70℃冰箱过夜后，放入液氮中保存备用。

需要解冻时，将冷冻管从液氮中取出后迅速投入37℃温水中。待细胞完全解冻后在无菌环境下将上清弃去，用培养液配置成细胞悬液，并用台盼蓝染色检测活细胞数，备用。

2 结果

2.1 东北林蛙输卵管上皮细胞分离结果

通过上述分离方法分离获得林蛙输卵管上皮细胞，通过台盼蓝染色看出活细胞达95%以上，分离方法可行。

2.2 东北林蛙输卵管上皮细胞培养结果

通过显微镜观察发现，分离所得的输卵管细胞为圆饼状，胞浆饱满，细胞核清晰可见，呈悬浮状态，培养24 h后，细胞大部分都处于贴壁状态，多数伸展呈卵圆形，类似眼睛状，成簇生长，排列紧密，7 d后长满培养瓶瓶底，开始传代培养。

3 讨论

3.1 细胞培养技术的质量控制管理

细胞培养技术自诞生以来，广泛应用于细胞工程技术、基因工程技术、酶工程技术和发酵工程技术等领域，随着现代医药的发展，细胞培养技术在生物制品的开发、生物大分子分析、临床药物开发等领域也得到广泛应用。细胞培养所用的细胞可以是分离纯化的原代细胞，也可以是购买的细胞株。随着细胞培养技术的广泛应用，由于实验室条件，细胞培养所需试剂以及细胞培养技术质量控制的差异，导致细胞生长缓慢、细胞株间交叉污染以及遗传突变等风险越来越大[3]。该研究从实验室细胞培养条件和培养试剂出发，研究细胞培养的质量控制管理，为东北林蛙输卵管上皮细胞的培养提供良好的技术支持。

3.2 东北林蛙输卵管上皮细胞质量控制管理

该研究选取20只生长在吉林省长白山地区的产卵前雌性东北林蛙。采用sigma公司生产的DMEM培养基和Hanks液，无菌环境下加入定量的青链霉素以及15%血清，并采用0.22 μm滤膜过滤，确保培养液的质量。采用0.25%的消化酶分离纯化林蛙卵上皮细胞，严格控制消化酶的浓度和消化时间，细胞胰蛋白酶消化法：该方法获得较多的单细胞及体积较小的细胞团块，部分细胞形态不完整，一般在接种细胞在贴壁后增殖速度较慢，细胞悬液中细胞碎片较多，培养液较为黏稠。所以消化过程中要注意多次轻柔吹打，直至吹成单细胞悬液，防治形成的细小细胞团块影响贴壁及生长[4]。并且严格控制离心机的离心转速和离心时间，得到数量较多、活性较高的输卵管上皮细胞。在细胞培养的过程中严格控制培养条件，控制培养箱的温度和CO2的浓度，浓度较高的胎牛血清是培养的关键，另外要注意培养瓶中接种浓度不可过密，培养瓶的培养液要根据细胞生长情况及时更换，在传代培养时注意消化酶的浓度和消化时间，不可过度消化，影响细胞活性，最后需要注意的是无菌环境和操作技术，避免染菌[5]。冻存细胞时要注意遵循“慢冻快溶”的原则，严格把握冷冻阶段时间，冷冻液的配置要注意DMSO和培养液的比例，注意防护液氮冻伤。质量较好的试剂、良好的无菌操作环境和精良的操作技术是成功培养林蛙输卵管上皮细胞的关键。该研究结果显示通过上述分离方法分离获得林蛙输卵管上皮细胞，通过台盼蓝染色看出活细胞达95%以上，细胞圆形，形态饱满，分离方法可行。通过显微镜观察发现，分离所得的输卵管细胞为圆饼状，胞浆饱满，细胞核清晰可见，呈悬浮状态，培养24 h后，细胞大部分都处于贴壁状态，多数伸展呈卵圆形，类似眼睛状，成簇生长，排列紧密，从形态学角度确定是林蛙输卵管上皮细胞。该研究建立的东北林蛙原代输卵管上皮细胞分离培养方法可获纯度较高的输卵管上皮细胞，为后续研究东北林蛙输卵管上皮细胞的形态功能及东北林蛙体外胚胎共培养体系的建立提供实验基础。

[1]郑鑫，刘景圣，夏清娟,等.中国林蛙输卵管上皮细胞的培养及其生物学特性研究[J].食品科学,2006,27(5):118-121.

[2]张秀平，陈陆，刘红英，等.鸡原代输卵管上皮细胞体外分离培养与鉴定[J].中国兽医学报,2015，35(6)：999-1004.

[3]张文丽，孔凡虹，贺文艳，等.细胞培养实验中细胞系鉴定及质量控制重要性探讨[J].标记免疫分析与临床，2017，24（1）：84-87.

[4]孙永刚，徐惊涛，才让东智，等.牦牛输卵管上皮细胞分离培养和纯化鉴定[J].生物学杂志,2013,30(6):22-25.

[5]张仙保，郭梓茹，张嘉祺，等.不同培养条件对牛输卵管上皮细胞的影响[J].科技与推广，2016（21）:45-47.

R3

A

1672-5654（2017）09（c）-0104-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.27.104

张松玲（1979-）,男，吉林长春人，本科，副研究员，研究方向:保健食品开发与细胞培养。

何威（1981-）,女，吉林长春人，硕士，副教授，研究方向:中医脑病，E-mail:297378127@qq.com。

2017-06-25）