纸片扩散法抗菌药物敏感试验的质量控制

钟伟萍

山东省青岛大学附属威海市立第二医院，山东威海 264200

纸片扩散法抗菌药物敏感试验的质量控制

钟伟萍

山东省青岛大学附属威海市立第二医院，山东威海 264200

目的抗菌药物敏感试验是临床抗菌治疗的指导性实验。关系到抗菌药物治疗成败。方法多种方法中选WHO推荐使用的利于基层医院开展的纸片扩散法。结果日常常规操作中应控制好平板厚度、琼脂浓度、细菌接种量、琼脂种类及多种因素。结论在严把纸片扩散法抗菌药物敏感实验的操作过程的同时，有必要做好质量控制，确保结果准确性，服务于临床。

纸片扩散法；抗菌药物敏感试验；质量控制

在临床感染性疾病、菌种的耐药性、抗生素的合理应用等。抗菌药物敏感试验是实验室不可缺少的，常用方法有Etest法、稀释法、Kirby-Bauer法以下简称（K-B纸片扩散法）以及全自动微生物分析仪等。纸片扩散法是WHO推进使用的微生物敏感性测定方法[1]，能在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[2]。其特点是操作简单，测定的药物可随临床需要而调整，易检测个别特殊耐药菌株[3]，更重要是扩散法有一套完整的质量控制，结果可靠，是微生物常用方法，全自动或半自动仪器分析法是一种微量肉汤稀释法[4]。该文将平时工作中的质量控制要点阐述如下。

1 纸片扩散法误差原因

一次质量控制结果错误，常被认为是一种统计上的随机变化。

①接种平皿不均匀；②抑菌环量取记录直径有误；量取工具有误差；③标准菌株保存、污染、过期等改变；④细菌接种量，在K-B纸片扩散法药敏实验菌液量规范中提出固定接种0.35 mL菌液量[5]；⑤0.5管麦氏浊度管未摇匀、已过期；⑥孵育温度、时间、放置、气体等不合格；⑦MH培养基制作、深度、厚度、购入批次批号等有关；⑧药敏纸片质量改变。立即观察药物平板，重复试验一般能够解决，如仍失控必须恢复每日质控查找原因。⑨菌液浓度未得到控制；未混匀；⑩发现问题及时查找原因进行校正。

2 质控测定次数

MH琼脂和药敏纸片更换批次批号必须用质控菌株进行测试。检测标本时应与质控菌株一起检测可监控整个操作过程。当与常规标本一起连续测定质控菌株30 d或每种药物与相应的每种细菌的30个抑菌环直径少于3个结果超出常用抗菌药物纸片对质控菌株的抑菌环直经允许范围时。达到以上要求可每周1次检测。发现有一个不符合的结果立即查找原因。发现质控菌株错误、含药纸片种类错误或标准菌株被污染等及时纠正，如果不能发现原因立即改为每日检测。

3 抑菌环的质控

常用抗菌药物纸片对质控菌株的测定抑菌环直径应控制在的允许范围内。在连续20个实验的结果中只能有一个结果超出对应的范围。任何有一个以上的结果超出即认为是失控，及时纠正。

4 标准菌株

大肠埃希菌ATCC25922；大肠埃希菌ATCC35218（用于β内酰胺梅抑制剂复合制剂）；流感嗜血杆菌ATCC49247、ATCC49766（用于 HTM 培养基）；金黄色葡萄球菌ATCC25923；肺炎克雷伯菌ATCC700603；淋病奈瑟菌ATCC49226（用于GC琼脂）；铜绿假单胞菌ATCC27853；肺炎链球菌（用于 5%羊血 MH琼脂）ATCC49619。粪肠球菌ATCC29212。

5 质控菌株的保存

标准菌株复苏后的单个菌落接种于相对应的平皿上，培养18 h，将菌落用无菌的方法接种于40%甘油肉汤中，-20℃冰箱保存1年，每月用1支，在接种于对应的平板，培养出纯菌落在4℃冰箱保存1个月。需密封保存。对淋病奈瑟氏菌、嗜血杆菌等温度比较敏感，要快速冷冻长期储存，药敏试验对照用的不超过5次以上传代。注意对菌株的维护最少次数的传代和储存-60℃或以下。

6 药敏纸片的质量是做好药敏试验的关键

①纸片含药量高低是影响抑菌环大小的重要因素，用半饱和法制作的药敏纸片含量一般为10 μg，饱和法药敏纸片含量为20 μg[6]。pH为中性。药敏纸片厚度1 mm左右，这样适宜药物扩散利于细菌生长。纸片直径(6.00～6.35 mm)、重量、每片吸水性（20 uL）、酸碱度、金属离子等与纸片含药量有关。冷冻干燥制备。②新购药敏纸片抑菌圈大小不均。在用前必须检验每片差度（不大于1～2 mm）和准确度（实际药量与标准药量是否相符），达到标准后方可使用。长时间不用抑菌圈过小可能是抗生素降解，及时更换。③药敏纸片保存，常规用量之外的药敏纸片最好放于-20℃保存。常用的可在2～8℃保存1周。β-内酰胺类药敏纸片应冷冻储存，不超1周。在纸片保存如喹诺酮类药物注意避光保存。青霉素类、含有β内酰胺抑制剂和亚胺培南的纸片加干燥剂保存。④药敏纸片取出后应在室温平衡至少10 min以上再打开，避免冷凝水影响。完后及时冷冻冷藏。⑤不要使用过期的药敏纸片。

7 菌悬液浓度标准

用接种环挑取新鲜菌落悬浮于生理盐水中混匀，菌液浓度为1.50×108cfu/mL,为0.5管麦氏浊度标准管，用光度计625 nm测定吸光度为0.08～0.10，每月更换标准管。

8 培养基

①新购的MH琼脂或新自制的MH琼脂均应使用标准菌株、质控药敏纸片和标准来测试合格后使用。研究表明:选用国产和进口的5种琼脂，均表现出琼脂浓度越大，抑菌圈直径越小[7]。②培养基的制作:聂庆东等[8]实验室自制MH琼脂培养基与商品药敏琼脂平板比较，不同培养基抑菌环直径均符合《全国临床检验操作规程》的允许范围，其准确性有质量保证；药敏直径的差异对耐药、中介、敏感的折点判定产生影响；药敏直径相关性显示相关系数r>0.95，呈高度正相关。平板厚度应一直为4 mm，无菌试验合格。4℃使用一周，用前放35℃孵育箱30 min,过久或脱水不易使用。③尽可能降低MH培养基中的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶，可与磺胺类和甲氧苄胺嘧啶核苷有竞争，过量可抵消效应，抑菌环缩小模糊或消失，导致假耐药现象产生。自制的MH培养基也存在此现象[8]。用甲氧苄胺嘧啶或磺胺甲基异噁唑对粪肠球菌ATCC29212、ATCC33186进行测试，抑菌环清晰，直径≥20 mm，则胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶含量合格。④培养基中含有钙镁等离子，起到溶酶作用。影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌抗菌活性，含量过高，抑菌环变小。含量过低抑菌环变大。在配制过程中应用蒸馏水或去离子水，检测金属含量。⑤对特殊细菌应用改良培养基或选择培养基。⑥MH琼脂的pH7.2～7.4，不宜用目测或试纸比色。pH太低，能减轻氨基糖苷类、大环内酯类药物的抗菌活性，加强青霉素类药物的抗菌活性。

9 实验过程及结果测量

配置好的菌悬液应在15 min内接种，使用无菌棉试子，取校正的菌液，在液面上管壁内旋转挤出多余的菌液，在培养基表面涂3次，每次旋转平皿60°，在平皿周边涂2圈，保证均匀涂布。室温放3～5 min,吸收平板表面水分。各纸片距离＞24mm,与平皿边缘＞15mm。纸片一旦接触琼脂不应在移动位置。最好纸片平板应在15 min内翻转，致35孵育箱中18～24 h，平板最多2个叠起。受热均匀。结果用带表卡尺或精确度大1/10 mm的其他量具。根据NCCLS标准对量取的抑菌圈直径作出“敏感”“耐药”“中介”的判断。所有患者结果在报告前均需要审核,不常见的结果需要确证以后，确认无误发放检验结果。

10 结语

纸片扩散法抗菌药物敏感试验必须引起重视，确保药敏试验准确，避免误差，给临床用药提供可靠的治疗依据，防止用药不当产生耐药菌株延误治疗[9]。

[1]谭瑶，赵清.K-B纸片扩散法药物敏感试验[J].检验医学与临床，2010，7(20):2290-2291.

[2]王传新,王国礼.现代检验医学技术及质量控制[M].济南:山东科学技术出版社,2004:171.

[3]蓝锴.高昆山.官旭俊.不同方法检测粘液型铜绿假单胞菌药物敏感性结果准确性探讨[J].检验医学，2012,27(7):544-548.

[4]马驰.林居纯.陈雅莉，等.禽源金黄色葡萄球菌耐药性检测[J].中国兽医杂志，2010，46（9）:10-12.

[5]余修中,K-B法药敏实验中菌液量的规范[J].四川省卫生管理干部学院学报,2002,9(21):177-178.

[6]王亚霞,苏振杰,任凤秋.K-B纸片琼脂扩散法细菌药物敏感试验的影响因素分析[J]中国医药指南,2009,3(7)：41-42.

[7]张彩芳.张爱君.纸片扩散法药敏试验条件的选择[J].宁夏医学杂志,2006,28(12):946-947.

[8]聂庆东,张秀敏,黄鹤，等.实验室自制MH琼脂培养基与商品药敏琼脂平板比较分析及意义[J].中华实验和临床感染病杂志：电子版，2011，8(5)：9-13.

[9]杨文杰，陶家驹，张宾，等.大型综合医院524株细菌分离鉴定及其耐药性分析[J].中国全科医生，2001,4(10):781-783.

Quality Control of Anti-bacterial Drug Sensitive Test of Paper Diffusion Method

ZHONG Wei-ping
Weihai Municipal Second Hospital Affiliated to Qingdao University,Weihai,Shandong Province,264200 China

ObjectiveThe sensitive test of antimicrobial agents is the guiding experiment of clinical antibacterial therapy,which is related to the success or failure of antibacterial drug treatment.MethodsThe paper diffusion method of the primary hospital is recommended by the WHO among the various methods.ResultsThe plate thickness,AGAR concentration,bacterial inoculation,AGAR variety and various factors should be controlled in routine operation.ConclusionIn strict control of the paper diffusion method of antimicrobial susceptibility testing process,it is necessary to grasp the quality control to ensure the accuracy of the results,so as to serve the clinical practice.

Paper diffusion method;Sensitive test of antimicrobial agents;Quality control

R446.1

A

1672-5654（2017）09（b）-0038-02

2017-06-12）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.26.038

钟伟萍（1969-），女，山东威海人，本科，主管技师，主要从事临床检验工作。