辅助生殖与表观遗传

黄荷凤 陈露婷

上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院（200030），上海交通大学医学院胚胎源性疾病研究所，生殖遗传教育部重点实验室

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辅助生殖与表观遗传

黄荷凤 陈露婷

上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院（200030），上海交通大学医学院胚胎源性疾病研究所，生殖遗传教育部重点实验室

表观遗传（Epigenetics）是近年来生命科学的重大发现和研究热点之一。大量用经典遗传学无法解释的现象说明：相同的基因组完全可以具有不同的表型。例如，已公认同卵双生的孪生子具有完全相同的基因组，如果这两个孪生子在同样的环境下成长，按照经典遗传学理论，两人的气质和体质应该非常相似。但研究者发现，同卵孪生子随着年龄的增长，会患有不同的成年性疾病，并不符合预期理论。经典遗传学明确指出，遗传的分子基础是核酸，生命的遗传信息储存在核酸的碱基序列上。但近年来研究发现，在不影响DNA序列的情况下改变基因组的修饰，不仅可以影响个体发育，而且还可以遗传至其子代，甚至子二代。这类遗传变异就被称为表观遗传修饰，并被认为是导致遗传物质一致的孪生子出现个体差异的主要原因。由此可见，生殖与表观遗传密切相关。由于干预时间和措施的特殊性，辅助生殖技术（ART）与生殖遗传，特别是表观遗传具有密不可分的联系。本文将从表观遗传与基因印记、ART与表观遗传以及ART子代安全性三方面进行阐述。

1 表观遗传与基因印记

生殖遗传是指通过两性生殖细胞内染色体上的基因，将遗传信息一代一代传递下去，使子代具有亲代的表型特征，生殖遗传遵循孟德尔定律。表观遗传则是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。表观遗传具有后成修饰、不遵循孟德尔遗传定律、获得遗传改变表观遗传、可逆性的基因调节4个特点，从DNA修饰、蛋白修饰和非编码RNA调控3个层面调控基因的表达。表观遗传学研究主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、X染色体失活和基因印记等方面。DNA甲基化是一种主要的表观遗传修饰形式，调节染色质结构和基因表达，目前表观遗传学领域的研究大多从甲基化状态入手。组蛋白修饰指核小体游离在外的N－端可以受到乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和ADP核糖基化等各种各样的修饰。X染色体失活使哺乳动物保持了体内染色体的平衡和性别的平衡，即剂量补偿效应，X染色体失活中心（XIC）是X染色体失活的关键作用元件。

基因印记（genomic imprinting）是表观遗传修饰的一种特殊形式，是指某些基因不遵守孟德尔定律（亲代来源不改变等位基因的行为），而根据来源于亲代的不同，在等位基因上发生的差异性表达，一般表现为某一等位基因不表达或表达极弱。具有印记的等位基因称为印记基因。印记基因不遵循孟德尔遗传定律的表达规律，而是亲缘性相关的差异性表达或抑制，即单等位基因表达或抑制。若印记在母源性等位基因位点，则该印记基因的母源性等位基因位点多表现为抑制（不表达），而该印记基因对应的父源性等位基因位点不抑制（多表达），这种印记基因称为母系印记；反之则称为父系印记。如定位于人类染色体11p.15.5上的胰岛素样生长因子2（IGF－2）为母源性印记基因，甲基化印记在母源性等位基因位点上，表现为母源抑制，父源表达。印记基因在有丝分裂中能稳定传递给子细胞，而在生殖细胞中，配子形成过程中擦除上一代的印记，建立新的印记并传递给子代；因此，在配子和胚胎发育过程中，印记基因经历擦除、重建、维持三个阶段。母系印记的建立始于出生后的卵母细胞生长期，直到受精后才全部完成；父系印记的建立早于卵子，开始于出生前，主要发生在减数分裂之前的精原细胞阶段，到出生时基本结束。

印记基因多成群存在，功能上多相互关联。每个子代个体的基因组印记在亲代配子发育成熟阶段重新形成，形成的基因组印记在配子形成受精卵后保持稳定，影响子代个体（含胎盘）的生殖发育和出生后的生物学行为，与个体生长发育、胎盘发育、肿瘤发生和神经缺陷疾病及其他人类遗传病的发生密切相关。印记基因的存在反映了性别的竞争，从目前发现的印记基因来看，父系表达基因促进子代生长发育、增大胎儿的体型，而母系表达基因则是限制子代的无限生长，避免消耗过多资源。因此沉默父系表达基因导致胎儿宫内生长迟缓，而沉默母系表达基因则引起胎儿过度生长、营养需求增多。父母系基因在后代发育中相互拮抗，以维持发育的平衡，即为“父母印记基因矛盾假说（Parent Conflict Hypothesis）”。

2 辅助生殖技术与表观遗传

ART包括体外受精－胚胎移植（IVF－ET）、卵胞浆内单精子注射（ICSI）、宫腔内人工授精（IUI）以及植入前遗传学诊断（PGD）等。关于ART与印记基因疾病的相关性随着表观遗传学的发展已成为生殖安全研究的前沿和热点。大量研究显示，在患者不孕不育影响下，超促排卵（COS）、卵子体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）、胚胎操作等非生理性干预可从不同角度、不同程度对子代表观遗传造成干扰，从而引发印记基因疾病。自2002年Cox等［1］报道ICSI可增加Angelman综合征（AS）风险以来，多项研究指出，ART出生子代中由基因印记缺陷导致Beckwith－Wiedemann综合征（BWS）和AS患病率明显升高。BWS和AS是两种最常见的印记基因疾病，在自然妊娠子代中罕见。AS与ICSI相关性明显，已证实其与染色体15q11－q13上SNRPN基因印记异常有关，而非DNA基因序列改变引起，而BWS与IVF和ICSI都有相关性，部分患者存在LIT1和H19基因印记异常，也有部分患者母源性等位基因KvDMR1区域存在甲基化丢失。

超促排卵阶段与配子发育阶段高度重合，这个阶段正是印记基因的甲基化等表观遗传修饰的主要阶段，因此更有可能干扰基因组印记的建立和维持。母系印记基因较父系印记基因更易受到外界环境影响。研究表明，ART引起的BWS和AS都是母源基因低表达或不表达引起的，而由于父源基因表达受抑制引起的类AS疾病Prader－Willi综合征（PWS）却未与ART显著相关，这印证了母源等位基因印记异常时ART相关印记基因疾病的重要发病机制。众多排除了不孕症背景干扰的动物促排卵模型研究表明，体内授精的促排卵组小鼠在2细胞胚胎时整体基因组甲基化异常概率更高［2］，在促排卵小鼠不同时期的胚胎和胎盘中，Igf2／H19、Kcnq1lot1和Snrpn等多个重要的印记基因表达水平与甲基化状态都有明显改变［35］。

卵子体外成熟（IVM）以及卵子或卵巢组织冷冻技术，在保存生育力方面发挥了重要作用，为手术后、化疗后卵巢功能损伤较大的女性患者提供了生育机会。在ART中，为避免卵巢过度刺激，IVM有时也充当了替代促排卵以获得成熟卵子的手段。虽然由于IVM技术尚未广泛应用于临床，目前还未发现由IVM造成的ART相关印记基因疾病，但已有研究证据表明，人和小鼠卵子经过IVM后，H19、Mest／Peg1等印记基因均出现异常甲基化［67］。但关于IVM对卵子基因印记的获得、擦除及重建是否有干扰及干扰机制仍存在争议，有待进一步研究验证。

IVF不仅使受精这一妊娠重要环节脱离了母体环境，并伴随着大量对受精卵的体外操作，这两个因素均可能引起印记异常。而ICSI更是绕过了人类天然的优胜劣汰选择，让活力不足、质量低下的精子获得使卵子受精的机会，更有可能引起表观遗传学异常。与体内授精相比，IVF的胎盘和脐带血中有7000多个基因的平均甲基化程度发生明显改变，相应的基因表达也随之出现差异［8］。也有证据提示，到囊胚期为止，ICSI与常规IVF的表观遗传学异常改变，包括基因组总甲基化程度与染色质结构改变是相似的［9］。不过，与ICSI相比，未成熟精子卵浆内注射（ROSI）胚胎存在更多的表观遗传修饰异常，可能导致胚胎发育异常。

胚胎培养与移植等胚胎体外操作应用甚广，因此非自然环境下成长的胚胎能否保持正常的表观遗传修饰，ART相关印记基因疾病是否与胚胎操作有关，得到广大学者的密切关注。胚胎体外培养不仅会引起印记基因甲基化异常［10］，更可能产生远期的健康损害［11］。由于临床中的胚胎体外培养必定伴随着对胚胎的人工操作，所以单纯研究体外培养对胚胎印记基因的影响较难实现。也有研究表明，仅进行胚胎收集、胚胎移植而基本不进行胚胎培养也会引起多个印记基因的表达水平异常和甲基化异常，甚至“大胎综合征”（Large Offspring Syndrome，LOS）等印记基因疾病。

3 辅助生殖技术子代安全性

ART解决了大量不孕夫妇的生育问题，且其中很多技术都与优生密切相关，特别是PGD和胚胎植入前遗传学筛查（PGS）技术，可以从根本上阻止某些遗传病和先天性疾病的发生，但大量流行病学调查研究显示，ART子代不良健康风险增加，且罕见遗传病和表观遗传疾病发生率增加。因此ART的子代安全性问题已经日益引起人们的广泛关注。ART子代健康风险，又称为胚胎源性疾病（EFOD）［12］，是指配子发生和胚胎发育异常引发的子代出生后不良健康状态，既可表现为发育迟缓和出生缺陷，也可表现为儿童和成人期糖尿病、心血管病等慢性疾病，甚至可能影响生育及出现隔代不良遗传风险。胚胎源性成人疾病主要包括四大类：①代谢性疾病，如糖尿病；②心血管疾病，如高血压、冠心病；③精神类疾病，如自闭症、脑瘫；④肿瘤性疾病。胚胎源性成人疾病具有传代效应，甚至隔代传代效应，如宫内高糖环境能引起雄性子代生殖细胞Igf2／H19基因印记异常，并通过父系遗传引起子二代的出生体重增加［13］。

ART的遗传风险是ART子代安全性研究的主要内容。ART子代安全性主要受到以下两方面的威胁：一是ART技术实施过程中发生的突变基因和DNA修饰异常通过生殖细胞直接影响子代，二是通过IVF和胚胎移植技术将父母生殖障碍相关致病因子或将家族性遗传病基因传递给子代。所以，对不孕遗传背景的深入分析、对ART操作安全性的全面评估均是我们关注的重点问题。在遗传学背景方面，生育年龄（特别是女性高龄）、生殖系统疾病、遗传病等均为子代遗传安全性的关键影响因素。研究表明，女性妊娠前高雄激素症可增加子代糖代谢异常的风险，而表观遗传改变的传代效应可能是其分子机制之一［14］。中重度少精症患者精子印记基因DNA发生差异甲基化区域（DMR）甲基化异常，精子发生异常患者存在DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达异常和MEST基因甲基化异常，少精症患者H19甲基化水平下降。在ART本身操作安全性方面，超促排卵、配子体外成熟、胚胎体外培养、显微操作、胚胎冻融等干预都有可能对配子和胚胎的发育造成影响。对ART子代胎盘的蛋白表达谱的全面筛查结果显示，ART子代胎盘中存在差异表达蛋白，这些蛋白涉及胎盘功能的多个方面；对ART子代的Y染色体微缺失的筛查结果显示，ART子代Y染色体的新发微缺失发生率增高；对ART子代的基因组学研究结果显示，ART子代存在差异表达基因，且部分为印记基因，并伴随基因印记修饰的改变。因此，ART可能会增加子代不良健康的风险，其影响涉及到基因、蛋白表达等多个层次，从而影响子代表型。在临床上，可以从以下几方面不断改进ART技术，以减少可能产生的ART子代风险：①个体化的促排卵方案；②接近人类正常体液和宫内环境的培养基；③克服体外操作损伤；④适时的胚胎移植策略。

综上所述，ART技术与生殖遗传密切相关，学习和掌握现代遗传、表观遗传学知识是每个生殖医学工作者所必需的。遗传异常往往是导致不孕症的一个重要原因，对不孕症患者治疗前进行遗传学分析，可有效防止遗传缺陷的垂直传递。生殖医学工作者需密切关注ART子代状态，采取适当措施控制不良风险发生。同时，我们也必须认识到，ART子代中遗传与表观遗传异常风险尚需进一步研究，并分析其与ART操作的具体关系，不断提高技术水平，在利用ART为人类解决不孕问题的同时，重视生殖健康和生殖安全，提高人口素质。

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［责任编辑：张 璐］

10.3969／j.issn.1004－8189.2017.04.001

2017－03－15