虎门合剂对成瘾模型及戒断大鼠GABA免疫阳性神经元的影响

丁尤放++林涵++李树春

【摘要】目的：研究吗啡成瘾性和戒断大鼠在虎门合剂给药后GABA阳性神经元数量的变化。方法：通过提升传统建模方法建立大鼠成瘾模型和模型评估系统，同时利用免疫组化法观察虎门合剂给药后吗啡成瘾和戒断大鼠阳性细胞元的变化。结果：吗啡依赖大鼠海马CA1区和齿状回GABA阳性神经元数目明显减少，虎门合剂治疗组海马GABA阳性神经元数量和光密度均显著升高。结论：虎门合剂对吗啡损伤一般记忆的效应具有拮抗作用。

【关键词】物质依赖；γ-氨基丁酸（GABA）；海马；神经元；虎门合剂

【中图分类号】R965【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）21-0015-04

Influences from Traditional Chinese HuMen Composition on GABA Immune Positive Neurons of Morphine-Dependence and Withdrawal Rats

DING YoufangLIN HanLI Shuchun*

Institute of Chinese Minority Traditional Medicine， Minzu University of China， Beijing 100081， China

Abstract：Objective To discuss the changes occurring in GABA positive neurons of morphine-dependence and withdrawal Rats after given HuMen Composition. Methods Rats addiction models and model evaluation system were established in the study through improving the traditional methods of building models. At the same time， immunohistochemical method was used to observe the changes occurring in positive neurons of morphine-dependence and withdrawal Rats after given HuMen Composition. Results the number of positive neurons is obviously decreased in hippocampus CA1 and Dentate Gyrus areas of morphine-dependent rats. In the treatment group of HuMen Composition， the number of hippocampus GABA and optical density are all increased respectively. Conclusion HuMen Composition may have certain antagonistic effect in curing damaged memory induced by morphine.

Keywords：Addiction；GABA；Hippocampus；Neurons；HuMen Composition

虎门合剂为名医验方，在甘肃、河南等地进行的中药戒毒的临床研究中取得了满意的疗效。尤其是1996年底，该药在云南思茅等地的戒毒所进行临床研究时，快速、高效和无副作用的优点得到了当地有关部门的重视[1]。本方依据阿片类物质戒断综合征的病因病机特点，以中医气血脏象理论为指导，以阴阳双补、去瘀化痰、安神止痛，扶正固本等为治法，对改善成瘾患者稽延性戒断症状，对抗复吸具有明显疗效。

学习记忆在药物依赖中的作用已越来越引起人们的重视，甚至有人提出药物依赖是一种异常形式的记忆[2]。而老年性学习记忆能力减退的研究显示，与学习记忆有密切关系的隔海马投射系统除了有乙酰胆碱以外还有GABA，并且隔核内的胆碱能神经元接受伏核GABA能神经元的支配，GABA能神经元的活动可调节胆碱能神经元的功能[3]。但在阿片类物质依赖所致学习记忆功能改变中GABA的变化及意义未见报道。本研究用免疫组化方法对各组大鼠海马GABA进行研究，试图找出GABA在阿片类物质依赖中的变化规律及其与学习记忆减退间的关系，以及虎门合剂对此的调节作用。

1实验材料

11实验动物：SPF级SD健康雄性大鼠，体重200～400g。数目：60只（北京维通利华实验动物技术有限公司），合格证号：SCXK（京）2006-0008。动物常规饲养，适应环境一周后，随机分为6组，每组10只。模型组按造模方法皮下注射（sc）吗啡，正常组sc生理盐水。中药组在造模同时以虎门合剂灌胃（ig），对照组在造模同时ig生理盐水。模后组在造模完成后以虎门合剂灌胃（ig），模后对照组在造模后ig生理盐水。

12试剂和仪器盐酸吗啡 （mor-phinehy-drochloride，MH）（沈阳市第一制药厂），L-精氨酸（L-Arg）、DAB、花生油，内源性生物素封闭液（ABB）、3%正常羊血清，GABA抗血清，生物素结合IgG（Co1∶200），ABC复合物 （武汉博士德生物工程有限公司），虎门合剂免煎剂（北京中医药大学制剂室）。CM1900横冷式冰冻切片机（德国LAICA公司），Observor行为学研究装置（荷兰NODULES公司）。

2实验方法

21大鼠成瘾模型的建立大鼠称重，采用盐酸吗啡背部皮下注射，对照组将吗啡换成生理盐水，其他处理与模型组相同。给药时间及剂量见表1。

22免疫组织化学取实验大鼠，快速开胸，经左心室主动脉插管，生理盐水快速冲洗后，灌入预冷的4%缓冲多聚甲醛500mL，含025%戊二醛，取脑后固定2～4h，再转入20%蔗糖中，于-70℃冰冻保存。作厚5μm冠状冰冻切片，对含背侧海马的组织切片隔五取一，依次加入含3%正常羊血清中30min（37℃），001mol/L、PH74 PBS接片，03%（体积分数）甲醇过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，03%（体积分数）TritonX100 37℃处理30min，ABB封闭内源性生物素。切片上加入GABA一抗（1∶100）及正常血清，4℃下孵育48～72h，加入二抗室温3h，SABC室温反应2h，DAB/H2O2呈色，明胶贴片，脱水透明，中性树胶封固。PBS代替一抗作为阴性对照。

3数据处理

数据均以（x±s）表示，采用SPSS115 统计软件进行方差分析及两两比较进行统计学处理，对3组大鼠各脑区的NA进行单因素方差分析。P<005为差异具有统计学意义。

4结果

41大鼠成瘾模型的评定各组在末次注射后12小时将大鼠放入行为学观察记录箱中，1min后开始用Observor观察戒断体征，历时20min，戒断体征分为可数和不可数体征，可数体征包括：齿颤，咀嚼，直立，湿狗样抖动，跳跃。直接记录20min内的次数得分。不可数体征包括：上睑下垂、流泪、流涎、眨眼、腹泻等，按评分标准评定（表2）。凡有接触惊叫大鼠均增加2分。全部体征得分之和为戒断总评分[3]。

吗啡成瘾大鼠和对照组大鼠戒断后，经过20min观察，两组动物戒断症状出现频次情况见表3。可见，吗啡成瘾大鼠模型的建立是成功的。模型组自然戒断诱发戒断症状结果是（3482±053）次，对照组的结果是（101±064）次，差异具有统计学意义（P<001）。

42海马不同亚区GABA阳性神经元的分布海马结构内GABA免疫组化染色可见阳性胞体和突起，细胞分布于海马各区，其中CA1区较多，并可见有较长突起的Golgi样染色细胞（图1A）。齿状回分子层的细胞相对稀疏（图1B）。

与正常组相比，GABA免疫染色阳性细胞在模型动物海马内的密度较低，定量结果显示，海马结构内CA1区的GABA阳性细胞与模型组对比明显减少，差异具有统计学意义（P<001）（图1C），齿状回分子层内的GABA阳性细胞（图1D）在模型组表达与正常组比较差异无统计学意义（P<005）。见表4。

中药组海马内GABA阳性神经元在CA1区数目与模型组相比有统计学意义（P<001）（图1E、F）。中药对照组海马结构内GABA阳性神经元见于CA1、CA3区和齿状回，各区的细胞形态和分布模式与对照组和模型组比差异无统计学意义（P>005）。但在CA1区GABA阳性神经元数目与中药组比较显著降低，差异具有统计学之义（P<001）（表4），染色的强度也极度变淡（图1G、H），说明中药具有治疗作用。

5讨论

GABA是哺乳类中枢神经系统中的主要抑制性神经递质，广泛分布于与学习记忆有密切关系的隔海马投射系统。与学习记忆有密切关系的隔海马投射系统除了有乙酰胆碱以外还有GABA，并且隔核内的胆碱能神经元接受伏核GABA能神经元的支配，GABA能神经元的活动可调节胆碱能神经元的功能[5]。GABA在老年学习记忆能力损害的过程中起着非常重要的作用[6]。有研究显示行为学训练前隔区内注射GABA受体激动剂可损害动物的空间学习记忆能力，若训练后给药则可易化学习过程；训练后纹状体内注射GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱可引起严重的逆行性遗忘症[7]。此外，GABA代谢酶抑制剂可通过提高脑内GABA水平而加重基底核损伤所致的空间定向能力障碍[8]。因此，可以认为GABA是参与学习记忆过程的另一重要的神经递质系统。

在海马GABA存在于非锥体神经元，按其与其它递质的共存情况可分为多种亚型：①含钙结合蛋白的GABA能中间神经元，主要是含小白蛋白和钙结合素D28K。②含神经肽的GABA能神经元，目前已发现的GABA能神经元内的神经肽有生长抑素，胆囊收缩素，血管活性肠多肽和神经肽-Y。③含一氧化氮合酶的GABA能神经元。④不含上述物质的GABA能神经元。这些亚群间的神经元有很多相互重叠，即GABA能神经元可与多种神经活性物质共存。如大鼠海马CA1区GABA阳性神经元中约有30%含有PV，而PV阳性神经元中有96%含CaBP，14%PV阳性神经元含有SOM。可见GABA神经元是一类非常复杂的神经元[9]。

本交实验结果显示，模型组海马本部各区的GABA能神经元均明显减少（P<001）；在齿状回分子层，GABA阳性神经元的光密度在模型组明显少于对照和中药组；而成瘾组与用药对照组之间没有明显差异（P>005）。因此，可以认为海马CA1区和CH区的GABA能神经元在戒断时明显减少，但学习记忆能力的改变究竟是GABA的直接作用还是GABA通过影响其他神经递质而间接作用，还有待进一步的研究。

众所周知，海马结构内的GABA能神经元是一类中间神经元。它接受基底前脑GABA能传入纤维的支配，而不接受胆碱能传入纤维和谷氨酸能传入纤维的支配。它发出的轴突支配海马的锥体细胞。损伤研究显示，致癫痫药物可引起海马内GABA免疫反应终扣的丢失，并有不同程度的GABA能神经元结构损伤，表现为线粒体肿胀，细胞器崩解和神经末梢变性[10]。也有研究显示[11]，GABA可通过控制其靶细胞BDNF的表达水平而调节海马中间神经元的表型，表现在发育早期GABA可促进神经元以旁分泌的形式产生大量BDNF，从而使GABA能中间神经元体积增大，表达NPY增加，发育晚期，GABA抑制BDNF合成，GABA受体激动剂蝇蕈醇可引起中间神经元体积缩小，NPY表达减少。NPY是与GABA共存的一种神经肽，可抑制CA1区和CA3区锥体细胞的兴奋性传递。可见GABA有可能是成瘾过程中GABA能神经元环路变性的一种使动因子。

本实验发现虎门合剂治疗组海马GABA均有所升高，说明虎门合剂对吗啡的损伤一般记忆效应具有拮抗作用。这种改善作用可能是中药促进学习记忆的一般机制之一。同时按着中医对脑病的研究成果来看，完全可以将依赖疾病定义为脑络之病，至少是一种脑病。

参考文献

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（编辑：梁志庆）